發(fā)布時(shí)間：2017-07-20 00:21

  本文關(guān)鍵詞：激活轉(zhuǎn)錄因子3促進(jìn)皮膚癌細(xì)胞增殖機(jī)制初探

  更多相關(guān)文章： 激活轉(zhuǎn)錄因子3 信號(hào)傳導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄激活物3 p53 p21 皮膚癌

【摘要】：背景： 皮膚癌是臨床上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，可籠統(tǒng)分為惡性黑色素瘤和非黑色素瘤性皮膚癌，后者主要包括鱗狀細(xì)胞癌和基底細(xì)胞癌。皮膚癌嚴(yán)重者可危及生命，其發(fā)病率逐年上升，已經(jīng)成為了一個(gè)全球性的公共健康問(wèn)題。多種危險(xiǎn)因素可導(dǎo)致皮膚癌的發(fā)生，包括內(nèi)源性因素（遺傳因素、基因突變等）和外源性因素（如紫外線暴露，化學(xué)致癌物質(zhì)和其他環(huán)境壓力）。早期診斷和治療，可以減少因該病所造成的死亡和畸型。然而，皮膚癌發(fā)生的確切分子機(jī)制仍不清楚，這嚴(yán)重的影響了對(duì)于該病的治療和預(yù)防。 激活轉(zhuǎn)錄因子3（ATF3）是ATF/CREB轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，特征性的含有堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）基序。正常細(xì)胞中ATF3的表達(dá)處于較低水平，但可由多種不同的胞外信號(hào)誘導(dǎo)而迅速上調(diào)表達(dá)，包括生長(zhǎng)因子，細(xì)胞因子和某些基因毒性應(yīng)激劑。做為轉(zhuǎn)錄因子，ATF3廣泛參與人體的多種生理功能，包括維持身體內(nèi)環(huán)境平衡，傷口愈合，細(xì)胞粘附，腫瘤細(xì)胞侵襲，細(xì)胞凋亡和信號(hào)通路等。新的證據(jù)表明，ATF3可能通過(guò)調(diào)整增殖和凋亡信號(hào)之間的微妙平衡關(guān)系，影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。值得思考的是，ATF3在腫瘤發(fā)展中發(fā)揮的作用不盡相同，這可能取決于細(xì)胞的類型和所處的環(huán)境背景。有報(bào)道提示，免疫抑制宿主ATF3高表達(dá)可抑制p53依賴的細(xì)胞衰老，從而增加了皮膚鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生的可能性，但在皮膚癌背景下，ATF3與p53兩者之間的相互作用關(guān)系，以及ATF3促進(jìn)皮膚癌發(fā)生的分子機(jī)制仍不明確。 信號(hào)傳導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄激活物3（Stat3）是生長(zhǎng)因子受體（GFR）下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，調(diào)節(jié)著參與細(xì)胞周期進(jìn)程，細(xì)胞凋亡，血管生成，腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)靶基因的表達(dá)，其在腫瘤發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。有研究顯示，Stat3在許多上皮癌，包括頭和頸、乳腺、肺、皮膚、前列腺癌中存在組成型激活；表皮特異性Stat3缺陷小鼠皮膚癌發(fā)生相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Stat3在上皮癌啟動(dòng)和促進(jìn)階段均發(fā)揮著重要作用。然而在ATF3促進(jìn)皮膚癌發(fā)生的過(guò)程中，Stat3的角色作用尚不清楚。 表遺傳學(xué)相關(guān)改變是腫瘤發(fā)生的另一重要機(jī)制，這其中就包括組蛋白乙�；Ｊ降氖д{(diào)。能夠阻斷組蛋白脫乙酰酶（HDAC）活性的組蛋白脫乙酰酶抑制劑（HDACi）已被研發(fā)并用于多種腫瘤的靶向治療。HDACi如曲古抑菌素A（TSA）和丁酸鹽，可改變正常的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致相關(guān)基因表達(dá)和調(diào)控的改變。已有報(bào)道，TSA可引起腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制并增加癌細(xì)胞的凋亡敏感性，同時(shí)有報(bào)道顯示，ATF3可能與HDACs發(fā)生物理性的相互作用，通過(guò)對(duì)乙�；揎椬饔玫恼{(diào)節(jié)，影響靶基因的表達(dá)，但ATF3在TSA誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制過(guò)程中的角色作用，特別是ATF3與TSA重要靶基因p21之間的相互作用關(guān)系，仍不明確。 目的： 在本實(shí)驗(yàn)中，我們擬利用qPCR技術(shù)和WB等技術(shù)分析ATF3在皮膚癌組織和皮膚癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況，同時(shí)聯(lián)合MTT法分析ATF3表達(dá)狀態(tài)對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響，從而進(jìn)一步明確ATF3與皮膚癌發(fā)生之間的關(guān)系；基于SCC-13細(xì)胞和p53缺失的RTS3b細(xì)胞，利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染和熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)等技術(shù)明確ATF3、p53和Stat3之間的相互作用關(guān)系，闡明ATF3對(duì)p53-Stat3級(jí)聯(lián)信號(hào)的影響；從表遺傳學(xué)角度，分析ATF3在TSA造成的表皮樣癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制過(guò)程中所發(fā)揮的作用，以及ATF3與TSA重要靶基因p21之間的相互作用關(guān)系。從而初步闡明ATF3促進(jìn)皮膚癌細(xì)胞增殖的可能分子機(jī)制。 方法： 1、皮膚癌組織ATF3的表達(dá)，皮膚癌組織來(lái)源原代培養(yǎng)細(xì)胞、SCC-13細(xì)胞，和p53缺失的RTS3b細(xì)胞ATF3的轉(zhuǎn)錄表達(dá)及蛋白水平測(cè)定：臨床來(lái)源的皮膚癌組織和正常皮膚組織各30例，利用qPCR技術(shù)，比較分析上述組織的ATF3轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，選取ATF3高表達(dá)的皮膚癌組織和ATF3低表達(dá)的正常皮膚組織各3例，建立原代培養(yǎng)細(xì)胞系，利用qPCR技術(shù)和WB技術(shù)分析皮膚癌組織來(lái)源細(xì)胞、正常組織來(lái)源細(xì)胞、SCC-13細(xì)胞，和p53缺失的RTS3b細(xì)胞ATF3的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況和蛋白表達(dá)水平。 2、利用MTT法比較分析皮膚癌組織來(lái)源和正常皮膚組織來(lái)源的原代培養(yǎng)細(xì)胞、SCC-13細(xì)胞和P53缺失的RTS3b細(xì)胞的增殖活性。 3、利用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)技術(shù)分析ATF3過(guò)表達(dá)對(duì)SCC-13細(xì)胞和P53缺失的RTS3b細(xì)胞Stat3轉(zhuǎn)錄活性的影響。 4、利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，分別使用ATF3shRNA質(zhì)粒，pcDNA3載體，pcDNA3-p53，pcDNA3-Stat3C和/或pcDNA3-ATF3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SCC-13和P53缺失的RTS3b細(xì)胞，并聯(lián)合使用Stat3抑制劑Stattic，后續(xù)利用MTT法對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖活性變化情況進(jìn)行比較分析，利用WB技術(shù)分析ATF3過(guò)表達(dá)對(duì)Stat3和p53蛋白水平的影響。 5、利用細(xì)胞培養(yǎng)聯(lián)合細(xì)胞轉(zhuǎn)染、qPCR和WB等技術(shù)，分析ATF3在TSA造成的表皮樣癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制過(guò)程中所發(fā)揮的作用，以及ATF3與TSA重要靶基因p21之間的相互作用關(guān)系。 結(jié)果： 1、qPCR檢測(cè)結(jié)果提示：與正常皮膚組織相比，皮膚癌組織中ATF3表達(dá)上調(diào)，而正常皮膚組織中ATF3表達(dá)處于較低水平。WB檢測(cè)結(jié)果顯示，ATF3高表達(dá)皮膚癌組織來(lái)源的原代培養(yǎng)細(xì)胞ATF3蛋白水平高于ATF3低表達(dá)的正常組織來(lái)源的原代培養(yǎng)細(xì)胞；蛋白表達(dá)水平與組間ATF3轉(zhuǎn)錄表達(dá)差異相一致。 2、MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，皮膚癌組織來(lái)源的原代培養(yǎng)細(xì)胞增殖活性明顯高于正常組織來(lái)源的原代培養(yǎng)細(xì)胞；利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，敲低ATF3表達(dá)后，SCC-13細(xì)胞增殖活性明顯降低，而ATF3增強(qiáng)表達(dá)則顯著提高了該細(xì)胞的增殖活性。 3、利用WB技術(shù)證實(shí)皮膚癌組織來(lái)源的原代培養(yǎng)細(xì)胞Stat3磷酸化水平明顯高于正常皮膚組織來(lái)源的原代培養(yǎng)細(xì)胞。利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)證實(shí)ATF3過(guò)表達(dá)SCC-13細(xì)胞Stat3磷酸化水平明顯高于ATF3敲低組，說(shuō)明ATF3為Stat3活化所需要，ATF3過(guò)表達(dá)上調(diào)了Stat3磷酸化水平。熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示ATF3正向調(diào)節(jié)Stat3的轉(zhuǎn)錄活性。實(shí)驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)，皮膚癌組織來(lái)源的ATF3高表達(dá)的原代培養(yǎng)細(xì)胞p53表達(dá)水平較低，ATF3敲低表達(dá)使SCC-13細(xì)胞p53表達(dá)上調(diào)，而ATF3過(guò)表達(dá)明顯抑制了該細(xì)胞株p53的表達(dá)水平。 4、P53缺失的RTS3b細(xì)胞Stat3磷酸化水平高于SCC-13細(xì)胞，利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)證實(shí)，ATF3過(guò)表達(dá)對(duì)P53缺失的RTS3b細(xì)胞的Stat3磷酸化水平和轉(zhuǎn)錄活性沒(méi)有影響，提示ATF3可能通過(guò)下調(diào)p53的表達(dá)來(lái)阻遏后者對(duì)Stat3活性的抑制作用。 5、組成型激活Stat3（Stat3C）顯著促進(jìn)了皮膚癌細(xì)胞生長(zhǎng)，這與ATF3功能相一致。相反，Stat3抑制劑Stattic抑制了SCC-13細(xì)胞的增殖活性，提示ATF3對(duì)皮膚癌細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用被Stattic所阻遏，提示ATF3對(duì)皮膚癌細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用主要是通過(guò)調(diào)節(jié)Stat3的活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的。此外，ATF3上調(diào)表達(dá)對(duì)SCC-13細(xì)胞增殖活性的促進(jìn)作用可被p53過(guò)表達(dá)所抑制，而ATF3上調(diào)表達(dá)對(duì)P53缺失的RTS3b細(xì)胞的增殖活性無(wú)顯著影響。提示，ATF3通過(guò)對(duì)p53-Stat3級(jí)聯(lián)信號(hào)的調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)了對(duì)皮膚癌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。 6、我們還從表遺傳學(xué)的角度對(duì)ATF3可能具有的促進(jìn)癌細(xì)胞增殖的作用進(jìn)行了初步研究，結(jié)果提示ATF3可能通過(guò)抑制p21基因表達(dá)干擾TSA引起的表皮樣癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制。 結(jié)論： 在皮膚癌組織中存在ATF3上調(diào)表達(dá)，ATF3上調(diào)表達(dá)具有促進(jìn)皮膚癌細(xì)胞增殖的作用。進(jìn)一步的研究表明ATF3可抑制皮膚癌細(xì)胞P53的表達(dá)，進(jìn)而削弱了p53對(duì)Stat3的抑制作用，致Stat3表達(dá)和活化水平上升，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖活性提高。ATF3通過(guò)調(diào)節(jié)p53-Stat3級(jí)聯(lián)信號(hào)通路，實(shí)現(xiàn)了其對(duì)于腫瘤細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用，這可能是ATF3促進(jìn)皮膚癌發(fā)生的主要機(jī)制之一。此外，ATF3促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖還可能存在著大量其他未知的機(jī)制，如在表遺傳學(xué)方面，我們發(fā)現(xiàn)ATF3可能通過(guò)抑制p21基因表達(dá)干擾TSA引起的表皮樣癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制。上述結(jié)果有益于我們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)皮膚癌發(fā)生的分子病理機(jī)制。ATF3過(guò)表達(dá)，增加了皮膚癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，ATF3表達(dá)水平或可成為判斷皮膚癌預(yù)后的指標(biāo)，，而ATF3-p53-Stat3級(jí)聯(lián)信號(hào)通路可能成為預(yù)防皮膚癌發(fā)生和治療該病的潛在靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：激活轉(zhuǎn)錄因子3 信號(hào)傳導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄激活物3 p53 p21 皮膚癌
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R739.5
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表5-7
• Abstract7-11
• 摘要11-15
• 第一章 前言15-18
• 第二章 皮膚癌組織和癌組織原代培養(yǎng)細(xì)胞中 ATF3、Stat3 和 p53 的表達(dá)18-30
• 2.1 引言18
• 2.2 材料18-21
• 2.3 方法21-25
• 2.4 結(jié)果25-27
• 2.5 討論27-29
• 2.6 小結(jié)29-30
• 第三章 ATF3 對(duì)皮膚癌細(xì)胞增殖和 p53-Stat3 信號(hào)通路的影響30-44
• 3.1 引言30
• 3.2 材料30-33
• 3.3 方法33-39
• 3.4 結(jié)果39-43
• 3.5 討論43
• 3.6 小結(jié)43-44
• 第四章 ATF3 對(duì) HDACi 誘導(dǎo)的表皮樣癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制中 p21 表達(dá)的影響44-56
• 4.1 引言44
• 4.2 材料44-47
• 4.3 方法47-50
• 4.4 結(jié)果50-54
• 4.5 討論54-55
• 4.6 小結(jié)55-56
• 全文結(jié)論56-57
• 參考文獻(xiàn)57-62
• 文獻(xiàn)綜述一62-78
• 參考文獻(xiàn)71-78
• 文獻(xiàn)綜述二78-101
• 參考文獻(xiàn)89-101
• 博士研究生期間發(fā)表論文101-102
• 致謝102

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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本文編號(hào)：565519