本文關鍵詞：4.1B對小鼠黑色素瘤細胞增殖、遷移和上皮間質轉化的影響

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【摘要】：研究目的目前,黑色素瘤已經(jīng)成為全球發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤之一。腫瘤轉移導致傳統(tǒng)治療方法不能取得理想的效果,因此,有效抑制腫瘤轉移可以改善黑色素瘤的治療效果。EMT在腫瘤轉移、干細胞性、耐藥性中發(fā)揮重要作用,因此尋找EMT相關的負調(diào)控因子,對惡性腫瘤的預防和預后都具有重要意義。蛋白4.1B是一種骨架蛋白,已有研究表明在多種腫瘤中蛋白4.1B呈現(xiàn)不同程度的表達下調(diào)或缺失,可能是一種潛在的腫瘤抑制因子。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)4.1B在B16和B16-F10細胞中均呈現(xiàn)表達缺失,構建pEGFP-N1-EPB41L3真核表達載體,探究4.1B在黑色素瘤細胞轉移中的作用。將外源性的EPB41L3基因轉染4.1B缺失表達的黑色素瘤細胞系,探討其對細胞的增殖和遷移能力的影響,以及在B16皮下移植瘤和B16-F10肺轉移中的作用,并初步探索4.1B調(diào)控黑色素瘤細胞EMT的分子機制。方法1.PCR和western blot技術篩選蛋白4.1家族在黑色素瘤細胞B16和B16-F10中的表達情況;熒光定量PCR進一步檢測EPB41L3基因的表達情況。2.構建pEGFP-N1-EPB41L3真核表達載體,轉染B16和B16-F10細胞,熒光顯微鏡觀察蛋白4.1B在黑色素瘤細胞內(nèi)的定位情況,PCR、熒光定量PCR以及western blot實驗方法檢測蛋白4.1B的表達情況。3.MTT法檢測蛋白4.1B對黑色素瘤細胞體外增殖的影響,細胞劃痕實驗檢測蛋白4.1B對其遷移能力的影響。4.熒光定量PCR和western blot技術檢測EMT相關標志物E-cadherin、vi mentin、MMP-2、MMP-9的表達情況。熒光定量PCR檢測啟動EMT相關的T GF-β家族成員、轉錄因子Snail、Slug、Twist 2基因的表達量。5.熒光定量PCR技術檢測蛋白4.1B對integrinβ1基因水平表達量的影響。流式細胞術檢測蛋白4.1B對細胞表面integrinβ1的表達以及活化的影響。6.B16皮下移植瘤模型以及B16-F10肺轉移模型評估蛋白4.1B的抑癌功能。結果1.小鼠黑色素瘤細胞系B16和B16-F10中,4.1R、4.1N、4.1G在核酸和蛋白水平均正常表達,但是蛋白4.1B在兩種細胞中都呈現(xiàn)表達缺失。2.成功構建了真核表達載體pEGFP-N1-EPB41L3,EPB41L3基因轉染細胞后熒光顯微鏡鏡檢,可觀察到綠色熒光。PCR、熒光定量PCR和western blot技術檢測結果顯示EPB41L3基因轉染后細胞均表達4.1B。3.蛋白4.1B對黑色素瘤細胞系B16和B16-F10細胞的體外增殖以及遷移具有抑制作用。4.蛋白4.1B表達后,上皮型標志物E-cadherin的表達出現(xiàn)明顯上調(diào),間充質型標志物vimentin、MMP-9的表達出現(xiàn)下調(diào)。蛋白4.1B可能通過抑制轉錄因子Snail、Slug、Twist 2基因的表達抑制EMT。5.蛋白4.1B對細胞表面integrinβ1的表達和活化沒有影響。6.蛋白4.1B對B16皮下移植瘤和B16-F10肺轉移具有一定的抑制作用。結論蛋白4.1B對B16和B16-F10細胞的增殖和遷移具有抑制作用,并且能夠通過下調(diào)相關轉錄因子Snail、Slug、Twist 2的表達水平,調(diào)節(jié)EMT相關標志物E-cadherin、vimentin、MMP-9的表達,從而抑制黑色素瘤細胞EMT,抑制腫瘤細胞的轉移。動物實驗結果進一步證實了蛋白4.1B能夠顯著性抑制B16皮下移植瘤的生長,對小鼠肺轉移模型中B16-F10的肺轉移也具有一定的抑制作用。
【關鍵詞】：腫瘤轉移 黑色素瘤 4.1B 增殖 EMT
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R739.5
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-14
• 常見英文縮寫一覽表（文中先后順序）14-16
• 第一章 引言16-23
• 1.1 黑色素瘤16
• 1.2 腫瘤轉移16-17
• 1.3 上皮間質轉化17-18
• 1.4 蛋白 4.1B18-20
• 1.5 研究目的與意義20
• 1.6 研究內(nèi)容與方法20-22
• 1.7 技術路線22-23
• 第二章 蛋白 4.1 家族在小鼠黑色素瘤細胞中的表達篩選23-38
• 2.1 材料23-26
• 2.1.1 細胞株23
• 2.1.2 主要試劑23-24
• 2.1.3 主要儀器24-25
• 2.1.4 常用試劑配制25-26
• 2.2 方法26-35
• 2.2.1 細胞培養(yǎng)的常規(guī)方法26-28
• 2.2.2 PCR法檢測蛋白 4.1 家族基因的表達情況28-30
• 2.2.3 Western blot技術檢測蛋白 4.1 家族的表達30-33
• 2.2.4 熒光定量PCR檢測EPB41L3基因的表達33-35
• 2.2.5 統(tǒng)計學分析35
• 2.3 結果35-37
• 2.3.1 PCR法初步篩選蛋白 4.1 家族的表達35-36
• 2.3.2 Western blot法檢測蛋白 4.1 家族的表達情況36-37
• 2.3.3 熒光定量PCR法檢測EPB41L3基因的表達情況37
• 2.4 討論37-38
• 第三章 真核表達載體p EGFP-N1-EPB41L3的構建和表達38-56
• 3.1 材料38-40
• 3.1.1 細胞株38
• 3.1.2 主要試劑38-39
• 3.1.3 主要儀器39-40
• 3.1.4 常用試劑配制40
• 3.2 方法40-46
• 3.2.1 小鼠EPB41L3基因的擴增40-41
• 3.2.2 真核表達載體p EGFP-N1-EPB41L3的構建41-43
• 3.2.3 熒光顯微鏡檢測 4.1B融合蛋白的表達43-44
• 3.2.4 PCR檢測EPB41L3的表達44
• 3.2.5 熒光定量PCR法檢測EPB41L3基因的表達情況44-45
• 3.2.6 Western blot法檢測蛋白 4.1B45
• 3.2.7 統(tǒng)計學分析45-46
• 3.3 結果46-55
• 3.3.1 小鼠EPB41L3基因的擴增結果46
• 3.3.2 繪制小鼠EPB41L3基因的外顯子圖譜46-47
• 3.3.3 真核表達載體p EGFP-N1-EPB41L3的鑒定47-50
• 3.3.4 熒光顯微鏡觀察 4.1B在細胞內(nèi)的表達情況50-52
• 3.3.5 PCR檢測EPB41L3基因的表達情況52
• 3.3.6 熒光定量PCR檢測EPB41L3基因的表達情況52-53
• 3.3.7 Western blot法檢測B16和B16-F10細胞表達蛋白 4.1B53-55
• 3.4 討論55-56
• 第四章 4.1B對B16、B16-F10細胞體外增殖和遷移的影響56-63
• 4.1 材料56
• 4.1.1 細胞株56
• 4.1.2 主要試劑56
• 4.1.3 主要儀器56
• 4.1.4 常用試劑配制56
• 4.2 方法56-59
• 4.2.1 MMT法檢測蛋白 4.1B抑制B16的體外增殖56-57
• 4.2.2 MTT法檢測蛋白 4.1B抑制B16-F10的體外增殖57-58
• 4.2.3 劃痕實驗檢測蛋白 4.1B對細胞遷移的影響58
• 4.2.4 統(tǒng)計學分析58-59
• 4.3 結果59-62
• 4.3.1 蛋白 4.1B抑制B16細胞的體外增殖59-60
• 4.3.2 蛋白 4.1B抑制B16-F10細胞的體外增殖60-61
• 4.3.3 蛋白 4.1B抑制黑色素瘤細胞系B16、B16-F10的遷移61-62
• 4.4 討論62-63
• 第五章 4.1B抑制黑色素瘤細胞EMT的機制研究63-75
• 5.1 材料63-64
• 5.1.1 細胞株63
• 5.1.2 主要試劑63-64
• 5.1.3 主要儀器64
• 5.1.4 常用試劑配制64
• 5.2 方法64-67
• 5.2.1 熒光定量PCR檢測EMT相關基因的表達64-65
• 5.2.2 Western blot法檢測EMT相關蛋白的表達情況65-66
• 5.2.3 流式細胞術檢測integrin β1 的表達和活化66-67
• 5.2.4 統(tǒng)計學分析67
• 5.3 結果67-73
• 5.3.1 蛋白 4.1B影響EMT相關marker的表達67-68
• 5.3.2 蛋白 4.1B對TGF-β 家族成員的影響68-69
• 5.3.3 蛋白 4.1B抑制驅動EMT的相關轉錄因子69-70
• 5.3.4 蛋白 4.1B對MMP-2 和MMP-9 的影響70-71
• 5.3.5 蛋白 4.1B對integrinβ1 的影響71-73
• 5.4 討論73-75
• 第六章 小鼠皮下移植瘤和肺轉移動物實驗驗證 4.1B功能75-80
• 6.1 材料75-76
• 6.1.1 細胞株75
• 6.1.2 主要試劑75
• 6.1.3 主要儀器75
• 6.1.4 常用試劑配制75-76
• 6.1.5 實驗動物76
• 6.2 方法76-77
• 6.2.1 蛋白 4.1B對B16皮下移植瘤的影響76
• 6.2.2 蛋白 4.1B對B16-F10肺轉移的影響76-77
• 6.2.3 統(tǒng)計學分析77
• 6.3 結果77-79
• 6.3.1 蛋白 4.1B對B16皮下移植瘤的影響77-78
• 6.3.2 蛋白 4.1B對B16-F10肺轉移的影響78-79
• 6.4 討論79-80
• 第七章 全文討論80-82
• 全文結論82-83
• 參考文獻83-88
• 個人簡歷、碩士期間發(fā)表的學術論文及研究成果88-89
• 致謝89

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