本文關(guān)鍵詞：Wnt5A基因沉默和過表達(dá)對黑素細(xì)胞功能的影響

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【摘要】：第一部分Wnt5A基因沉默對黑素細(xì)胞功能的影響目的研究Wnt5A特異性siRNA轉(zhuǎn)染原代人黑素細(xì)胞后,Wnt5A基因沉默對黑素細(xì)胞骨架蛋白和酪氨酸酶的影響,初步探索非經(jīng)典的Wnt通路相關(guān)基因?qū)谒丶?xì)胞骨架和黑素生成的影響。方法培養(yǎng)原代人表皮黑素細(xì)胞,將Wnt5A特異性siRNA通過脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染原代黑素細(xì)胞,采用實(shí)時熒光定量PCR確定轉(zhuǎn)染效率最高的實(shí)驗(yàn)方案(包括劑量、siRNA、時間點(diǎn))后,通過實(shí)時熒光定量PCR、蛋白印跡法測定Wnt5A轉(zhuǎn)染效率、并檢測下游ROR2、 Rac1、F-Actin、β-Tubulin及TYR的mRNA及蛋白表達(dá),并通過細(xì)胞免疫熒光法觀察細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)情況。使用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)或單因素方差分析法分析各組之間的差異。結(jié)果在siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,Wnt5A基因表達(dá)較空白對照及陰性對照組間均有明顯下降,干擾效率達(dá)91.0%; Rac1基因表達(dá)顯著高于陰性對照組,F-Actin、β-Tubulin及TYR基因表達(dá)在干擾組及對照組間均無明顯差異；Wnt5A蛋白表達(dá)較空白對照及陰性對照組間均有明顯下降,提示干擾成功,干擾效率達(dá)86.7%; TYR、 β-Tubulin蛋白表達(dá)比對照組明顯升高,分別約為2.6倍、2倍；ROR2、 F-Actin蛋白表達(dá)較對照組略下降；Racl表達(dá)無明顯差異。細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)未見細(xì)胞骨架較陰性對照組和空白對照組有明顯差異。結(jié)論成功建立了Wnt5A特異性siRNA轉(zhuǎn)染人黑素細(xì)胞使基因沉默的模型。Wnt5A特異性siRNA轉(zhuǎn)染原代黑素細(xì)胞后,TYR及β-Tubulin蛋白表白升高,黑素細(xì)胞骨架無明顯改變。第二部分Wnt5A基因過表達(dá)對黑素細(xì)胞功能的影響目的研究Wnt5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染原代人黑素細(xì)胞后,Wnt5A表達(dá)升高對黑素細(xì)胞骨架蛋白和酪氨酸酶的影響,初步探索非經(jīng)典的Wnt通路相關(guān)基因?qū)谒丶?xì)胞骨架和黑素生成的影響。方法培養(yǎng)原代人表皮黑素細(xì)胞,將合成的Wnt5A質(zhì)粒通過脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染原代黑素細(xì)胞,采用實(shí)時熒光定量PCR法、蛋白印跡法確定最佳的實(shí)驗(yàn)方案后,通過實(shí)時熒光定量PCR、蛋白印跡法測定Wnt5A轉(zhuǎn)染效率、并檢測下游RO2, Racl、 F-Actin, β-Tubulin及TYR的mRNA及蛋白的表達(dá),并通過細(xì)胞免疫熒光觀察細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)情況。使用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)或單因素的方差分析法分析各組之間的差異。結(jié)果在Wnt5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染黑素細(xì)胞后,Wnt5A mRNA表達(dá)較空白對照及陰性對照升高達(dá)800倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Rac1、 F-Actin、及TYRmRNA表達(dá)較空白對照及陰性對照升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；β-Tubulin mRNA表達(dá)較空白對照及陰性對照無顯著性差異。Wnt5A蛋白表達(dá)較空白對照及陰性對照升高達(dá)4.2-5.4倍,提示轉(zhuǎn)染成功；TYR蛋白表達(dá)較空白對照及陰性對照升高達(dá)3倍；Rac1、F-Actin蛋白表達(dá)較空白對照及陰性對照降低約50%；ROR2蛋白表達(dá)較空白對照及陰性對照降低約33.3%；β-Tubulin蛋白表達(dá)較空白對照及陰性對照升高約1.4倍。免疫熒光檢測各組間綠色、紅色熒光強(qiáng)度無顯著差異,但質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞體積明顯增大,樹突數(shù)目明顯增多,細(xì)胞骨架顯著改變,表現(xiàn)為F-Actin強(qiáng)弱不一,紋理模糊,張力絲斷裂,局部成團(tuán)塊狀。結(jié)論成功建立了Wnt5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人黑素細(xì)胞使基因過表達(dá)的模型。Wnt5A基因表達(dá)升高后,TYR的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯升高,可能促使黑素生成增加。Racl和F-Actin基因表達(dá)升高、蛋白表達(dá)降低,β-Tubulin蛋白表達(dá)升高,細(xì)胞體積增大、樹突增多、骨架改變,可能有利于黑素小體的輸送傳遞,參與色素沉著性疾病的發(fā)病過程。
【關(guān)鍵詞】：Wnt5A 小干擾核糖核酸 基因沉默 黑素細(xì)胞 細(xì)胞骨架 黑素生成 Wnt5A 小干擾核糖核酸 過表達(dá) 黑素細(xì)胞 細(xì)胞骨架 黑素生成
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R751
【目錄】：

• 中英文對照及縮略語6-8
• 中文摘要8-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-20
• 參考文獻(xiàn)16-20
• 第一部分 Wnt5A基因沉默對黑素細(xì)胞功能的影響20-47
• 第一節(jié) 原代人黑素細(xì)胞Wnt5A基因沉默模型的建立20-36
• 摘要20
• 研究背景及研究目的20-21
• 材料與方法21-30
• 結(jié)果30-34
• 討論34-36
• 第二節(jié) Wnt5A基因沉默對黑素細(xì)胞功能的影響36-47
• 摘要36
• 研究背景與研究目的36-37
• 材料與方法37-40
• 結(jié)果40-45
• 討論45
• 參考文獻(xiàn)45-47
• 第二部分 Wnt5A基因過表達(dá)對黑素細(xì)胞功能的影響47-76
• 第一節(jié) 原代人黑素細(xì)胞Wnt5A基因過表達(dá)模型的建立47-62
• 摘要47
• 研究背景與研究目的47
• 材料與方法47-57
• 結(jié)果57-60
• 討論60-62
• 第二節(jié) Wnt5A基因過表達(dá)對黑素細(xì)胞功能的影響62-76
• 摘要62
• 研究背景與研究目的62-63
• 材料與方法63-66
• 結(jié)果66-73
• 討論73-74
• 參考文獻(xiàn)74-76
• 全文小結(jié)76-78
• 論文相關(guān)文獻(xiàn)綜述78-85
• 參考文獻(xiàn)82-85
• 在讀期間發(fā)表的文章及參加的學(xué)術(shù)活動85-86
• 致謝86-88

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本文編號：526293