本文關鍵詞：Wnt5A基因沉默和過表達對黑素細胞功能的影響

  更多相關文章： Wnt5A 小干擾核糖核酸 基因沉默 黑素細胞 細胞骨架 黑素生成 Wnt5A 小干擾核糖核酸 過表達 黑素細胞 細胞骨架 黑素生成

【摘要】：第一部分Wnt5A基因沉默對黑素細胞功能的影響目的研究Wnt5A特異性siRNA轉染原代人黑素細胞后,Wnt5A基因沉默對黑素細胞骨架蛋白和酪氨酸酶的影響,初步探索非經(jīng)典的Wnt通路相關基因對黑素細胞骨架和黑素生成的影響。方法培養(yǎng)原代人表皮黑素細胞,將Wnt5A特異性siRNA通過脂質體法轉染原代黑素細胞,采用實時熒光定量PCR確定轉染效率最高的實驗方案(包括劑量、siRNA、時間點)后,通過實時熒光定量PCR、蛋白印跡法測定Wnt5A轉染效率、并檢測下游ROR2、 Rac1、F-Actin、β-Tubulin及TYR的mRNA及蛋白表達,并通過細胞免疫熒光法觀察細胞骨架蛋白表達情況。使用獨立樣本T檢驗或單因素方差分析法分析各組之間的差異。結果在siRNA轉染細胞后,Wnt5A基因表達較空白對照及陰性對照組間均有明顯下降,干擾效率達91.0%; Rac1基因表達顯著高于陰性對照組,F-Actin、β-Tubulin及TYR基因表達在干擾組及對照組間均無明顯差異；Wnt5A蛋白表達較空白對照及陰性對照組間均有明顯下降,提示干擾成功,干擾效率達86.7%; TYR、 β-Tubulin蛋白表達比對照組明顯升高,分別約為2.6倍、2倍；ROR2、 F-Actin蛋白表達較對照組略下降；Racl表達無明顯差異。細胞免疫熒光實驗未見細胞骨架較陰性對照組和空白對照組有明顯差異。結論成功建立了Wnt5A特異性siRNA轉染人黑素細胞使基因沉默的模型。Wnt5A特異性siRNA轉染原代黑素細胞后,TYR及β-Tubulin蛋白表白升高,黑素細胞骨架無明顯改變。第二部分Wnt5A基因過表達對黑素細胞功能的影響目的研究Wnt5A質粒轉染原代人黑素細胞后,Wnt5A表達升高對黑素細胞骨架蛋白和酪氨酸酶的影響,初步探索非經(jīng)典的Wnt通路相關基因對黑素細胞骨架和黑素生成的影響。方法培養(yǎng)原代人表皮黑素細胞,將合成的Wnt5A質粒通過脂質體法轉染原代黑素細胞,采用實時熒光定量PCR法、蛋白印跡法確定最佳的實驗方案后,通過實時熒光定量PCR、蛋白印跡法測定Wnt5A轉染效率、并檢測下游RO2, Racl、 F-Actin, β-Tubulin及TYR的mRNA及蛋白的表達,并通過細胞免疫熒光觀察細胞骨架蛋白表達情況。使用獨立樣本T檢驗或單因素的方差分析法分析各組之間的差異。結果在Wnt5A質粒轉染黑素細胞后,Wnt5A mRNA表達較空白對照及陰性對照升高達800倍,差異有統(tǒng)計學意義；Rac1、 F-Actin、及TYRmRNA表達較空白對照及陰性對照升高,差異有統(tǒng)計學意義；β-Tubulin mRNA表達較空白對照及陰性對照無顯著性差異。Wnt5A蛋白表達較空白對照及陰性對照升高達4.2-5.4倍,提示轉染成功；TYR蛋白表達較空白對照及陰性對照升高達3倍；Rac1、F-Actin蛋白表達較空白對照及陰性對照降低約50%；ROR2蛋白表達較空白對照及陰性對照降低約33.3%；β-Tubulin蛋白表達較空白對照及陰性對照升高約1.4倍。免疫熒光檢測各組間綠色、紅色熒光強度無顯著差異,但質粒轉染組細胞體積明顯增大,樹突數(shù)目明顯增多,細胞骨架顯著改變,表現(xiàn)為F-Actin強弱不一,紋理模糊,張力絲斷裂,局部成團塊狀。結論成功建立了Wnt5A質粒轉染人黑素細胞使基因過表達的模型。Wnt5A基因表達升高后,TYR的mRNA和蛋白表達均明顯升高,可能促使黑素生成增加。Racl和F-Actin基因表達升高、蛋白表達降低,β-Tubulin蛋白表達升高,細胞體積增大、樹突增多、骨架改變,可能有利于黑素小體的輸送傳遞,參與色素沉著性疾病的發(fā)病過程。
【關鍵詞】：Wnt5A 小干擾核糖核酸 基因沉默 黑素細胞 細胞骨架 黑素生成 Wnt5A 小干擾核糖核酸 過表達 黑素細胞 細胞骨架 黑素生成
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R751
【目錄】：

• 中英文對照及縮略語6-8
• 中文摘要8-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-20
• 參考文獻16-20
• 第一部分 Wnt5A基因沉默對黑素細胞功能的影響20-47
• 第一節(jié) 原代人黑素細胞Wnt5A基因沉默模型的建立20-36
• 摘要20
• 研究背景及研究目的20-21
• 材料與方法21-30
• 結果30-34
• 討論34-36
• 第二節(jié) Wnt5A基因沉默對黑素細胞功能的影響36-47
• 摘要36
• 研究背景與研究目的36-37
• 材料與方法37-40
• 結果40-45
• 討論45
• 參考文獻45-47
• 第二部分 Wnt5A基因過表達對黑素細胞功能的影響47-76
• 第一節(jié) 原代人黑素細胞Wnt5A基因過表達模型的建立47-62
• 摘要47
• 研究背景與研究目的47
• 材料與方法47-57
• 結果57-60
• 討論60-62
• 第二節(jié) Wnt5A基因過表達對黑素細胞功能的影響62-76
• 摘要62
• 研究背景與研究目的62-63
• 材料與方法63-66
• 結果66-73
• 討論73-74
• 參考文獻74-76
• 全文小結76-78
• 論文相關文獻綜述78-85
• 參考文獻82-85
• 在讀期間發(fā)表的文章及參加的學術活動85-86
• 致謝86-88

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