本文關(guān)鍵詞：羊口瘡病毒編碼的024蛋白調(diào)控NF-κB信號(hào)通路的分子機(jī)制

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【摘要】：羊傳染性膿皰病(Orf)又稱羊傳染性膿皰性皮炎,是由羊口瘡病毒(ORFV)引起的山羊和綿羊的一種急性、接觸性傳染病。易感羊群為3-6月齡的幼羊,多為群發(fā),而成羊發(fā)病多為散發(fā)。羊口瘡的典型特征是病羊口唇等處皮膚和黏膜形成紅斑、丘疹、膿瘡、潰瘍和結(jié)成疣狀厚痂。本病流行廣泛,世界各地均有發(fā)生,在我國(guó)北方、西北等羊群較多的地方比較常見(jiàn),是羊的主要疫病之一。 羊口瘡病毒(ORFV)為雙鏈DNA病毒,屬痘病毒科,副痘病毒屬。ORFV基因組全長(zhǎng)約135kb, G+C含量豐富(63%-64%),含131個(gè)預(yù)測(cè)基因。其中,病毒的基因組中部高度保守,在病毒復(fù)制和形態(tài)發(fā)生有重要作用,而兩端區(qū)域變異較大,多與病毒的毒性,致病及免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。 羊口瘡病毒(ORFV)被公認(rèn)具有強(qiáng)大的宿主免疫調(diào)節(jié)功能。痘病毒對(duì)宿主的免疫調(diào)節(jié)作用主要是通過(guò)編碼大量的免疫調(diào)節(jié)蛋白作用于宿主免疫或炎癥反應(yīng)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。NF-κB信號(hào)通路是病毒對(duì)宿主免疫調(diào)節(jié)的一個(gè)重要靶點(diǎn),該通路在病毒感染宿主致病的過(guò)程中起關(guān)鍵作用。課題組的前期研究發(fā)現(xiàn),羊口瘡病毒的新基因ORFV024是一個(gè)病毒早期基因,呈點(diǎn)狀分布于細(xì)胞質(zhì)中,與NF-κB信號(hào)通路有關(guān),其編碼蛋白均能抑制NF-κB活化。 ORFV024雖然位于基因組中部,但與其它的痘病毒和細(xì)胞內(nèi)蛋白同源性較低,羊口瘡病毒不同毒株之間,以及羊口瘡病毒與其他副痘病毒之間比較,其序列的變異都是較大的。將基因缺陷株OV-IA82Δ024與野生株OV-IA82同時(shí)感染OFTu細(xì)胞中,發(fā)現(xiàn)0RFV024不影響病毒的復(fù)制,但是,OV-IA82Δ024卻可以明顯降低細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。 ORFV024能抑制由NF-kappaB信號(hào)通路調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子的升高,(IL-6,IL-8),抑制作用點(diǎn)位于NF-κB信號(hào)通路的上游,通過(guò)抑制IKKα和IKKβ的磷酸化來(lái)影響NF-kappaB信號(hào)通路。但是,系列實(shí)驗(yàn)證實(shí)ORFV024與IKKα和IKKβ沒(méi)有直接的相互作用。所以O(shè)RFV024應(yīng)該是作用于IKKs上游的其它環(huán)節(jié),間接抑制IKKα和IKKβ的磷酸化。因此,本課題研究的目的是發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證NF-kappaB信號(hào)通路中與ORFV024相互作用的蛋白,進(jìn)一步明確ORFV024調(diào)控NF-κB信號(hào)通路的分子機(jī)制。 為保證整體實(shí)驗(yàn)研究的順利進(jìn)行,首先要解決羊口瘡病毒的大量培養(yǎng)問(wèn)題。ORFV可在牛、羊的皮膚細(xì)胞、腎細(xì)胞以及犢牛和羔羊的睪丸細(xì)胞上生長(zhǎng),并產(chǎn)生細(xì)胞病變,但這些細(xì)胞獲取過(guò)程復(fù)雜,需要大量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,成為研究ORFV的一個(gè)重要問(wèn)題。為此,我們建立了分離效率高、增殖快、操作簡(jiǎn)單且可長(zhǎng)期繼代的培養(yǎng)羊口瘡病病毒(ORFV)的原代細(xì)胞并進(jìn)行了培養(yǎng)鑒定。首先是是羊胚胎鼻甲細(xì)胞的原代培養(yǎng),在孕羊的腹部及子宮做手術(shù)剖口,取出胚胎備用。無(wú)菌取羊胚胎的鼻甲部位,胰蛋白酶消化,稀釋成5×105個(gè)/ml的細(xì)胞接種液,100mm培養(yǎng)皿接種10ml細(xì)胞接種液,置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),利用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況及形態(tài)變化。12h細(xì)胞已貼壁生長(zhǎng),呈梭形,72小時(shí)后細(xì)胞顯著增多。對(duì)其生長(zhǎng)曲線測(cè)定,發(fā)現(xiàn)其倍增時(shí)間為36h。ORFV-NA株感染OFTu,24h后可形成典型的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。通過(guò)免疫熒光發(fā)現(xiàn),病毒接種12h后,即可以檢測(cè)到ORFV的增殖。12h內(nèi)為病毒對(duì)細(xì)胞的適應(yīng)期,病毒增殖緩慢；12-24h為病毒的快速增殖期,36-72h病毒效價(jià)增加緩慢。利用該細(xì)胞我們構(gòu)建了OFTu文庫(kù),進(jìn)行羊口瘡病病毒的增殖及其外源基因表達(dá)的研究。 篩選ORFV024的宿主相互作用蛋白,選用酵母雙雜交系統(tǒng),該系統(tǒng)在研究蛋白質(zhì)之間的相互作用中應(yīng)用廣泛。首先,利用上述建立的OFTu細(xì)胞構(gòu)建OFTucDNA文庫(kù)。提取OFTu RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,合成單缽cDNA,經(jīng)過(guò)PCR合成雙鏈cDNA,然后共轉(zhuǎn)化cDNA和線性pGADT-Rec載體到Y(jié)187酵母內(nèi),涂SD/-Leu平板,4-5天收取酵母克隆,加入到營(yíng)養(yǎng)充足的液體培養(yǎng)基,分裝然后冷凍保存?zhèn)溆�。�?jīng)鑒定,我們構(gòu)建了0.57ML,細(xì)胞密度為7.5×107/ml,滴度為8.3×106cfu/ml的OFTU cDNA文庫(kù)。然后,要構(gòu)建ORFV024誘餌質(zhì)粒載體,篩選OFTu細(xì)胞cDNA文庫(kù)并尋找病毒蛋白ORFV024與宿主蛋白之間相互作用靶分子。024基因被克隆入pGBKT7載體中,經(jīng)自激活及毒性實(shí)驗(yàn)鑒定后,在酵母細(xì)胞中表達(dá),然后與OFTu文庫(kù)融合,涂于缺乏亮氨酸及色氨酸的平板上初步篩選,挑取藍(lán)色克隆于更為嚴(yán)格的培養(yǎng)基,缺乏亮氨酸,色氨酸,組氨酸及腺嘌呤再次篩選。在嚴(yán)格培養(yǎng)基中挑取呈現(xiàn)深藍(lán)色斑的克隆,提取酵母質(zhì)粒并測(cè)序。經(jīng)篩選鑒定,共得到61個(gè)陽(yáng)性克隆,通過(guò)DNA測(cè)序分析,其中包含11個(gè)蛋白序列。對(duì)11個(gè)序列蛋白都進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)其中兩個(gè)蛋白：IGFBP6(insulin-like growth factor binding protein6)和LAGE3(L antigen family, member3)與NF-KB通路相關(guān)。 進(jìn)一步通過(guò)定位研究、His-Pull down實(shí)驗(yàn)、免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)對(duì)ORFV-024與IGFBP6和LAGE3兩蛋白的相互作用進(jìn)行鑒定。通過(guò)基因克隆技術(shù)構(gòu)建帶有GFP標(biāo)簽的pEGFP-N1/IGFBP6和pEGFP-N1/LAGE3真核表達(dá)載體及帶有Flag標(biāo)簽的pCDNA3.0-Flag/IGFBP6和pCDNA3.0-Flag/LAGE3,轉(zhuǎn)染OFTu細(xì)胞,觀察其定位,發(fā)現(xiàn)兩蛋白與ORFV024在細(xì)胞中分布一致,其中IGFBP6彌散分布于細(xì)胞質(zhì)中,而LAGE3分布于整個(gè)細(xì)胞中。將構(gòu)建好的pCDNA3.0-Flag/IGFBP6和pCDNA3.0-Flag/LAGE3與pEGFP-N1/OFRV024共同轉(zhuǎn)入OFTu細(xì)胞中,經(jīng)過(guò)細(xì)胞免疫熒光染色后進(jìn)行激光共聚焦分析,發(fā)現(xiàn)在OFTu細(xì)胞中,ORFV024與IGFBP6和LAGE3之間有空間上的重疊,提示可能具有相互作用。 隨后進(jìn)行了His-Pull down實(shí)驗(yàn)�；蚩寺〖夹g(shù)構(gòu)建pET32a/ORFV024原核表達(dá)載體,表達(dá)純化,復(fù)性后,與His親和凝膠結(jié)合2h,再分別對(duì)pEGFP-N1/IGFBP6和pEGFP-N1/LAGE3及pCDNA3.0-Flag/IGFBP6和pCDN A3.0-Flag/L AGE3真核表達(dá)蛋白進(jìn)行Pull down, Western blot結(jié)果表明,024-HIS能與真核表達(dá)的LAGE3-GFP、LAGE3-Flag相互作用,但未觀察到ORFV024與IGFBP6間的相互作用。Co-IP觀察到相似的結(jié)果。293T細(xì)胞共轉(zhuǎn)染pCMVTAG4A-024和LAGE3-GFP或IGFBP6-GFP或GFP,轉(zhuǎn)染24h收細(xì)胞裂解,細(xì)胞裂解物用抗Flag抗體進(jìn)行免疫共沉淀,細(xì)胞裂解物及免疫沉淀后樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳,再用抗GFP抗體進(jìn)行Western blot分析,可見(jiàn)LAGE3-GFP與024-FLAG有相互作用,但I(xiàn)GFBP6-GFP與024-FLAG未觀察到相互作用。 綜上所述,本課題成功建立了分離效率高、增殖快、操作簡(jiǎn)單且可長(zhǎng)期繼代的培養(yǎng)羊口瘡病病毒(ORFV)的羊胚胎鼻甲細(xì)胞原代細(xì)胞,為羊口瘡病毒的體外增值和致病機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)；成功構(gòu)建了OFTu cDNA文庫(kù),為后續(xù)ORFV相互作用蛋白的研究提供了條件；篩選鑒定了ORFV024相互作用的宿主蛋白。采用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選獲得11個(gè)基因序列,其中IGFBP6和LAGE3與NF-κB信號(hào)通路相關(guān)。通過(guò)激光共聚焦、His-Pull down、Co-IP試驗(yàn)證實(shí)ORFV024與LAGE3之間存在相互作用,ORFV024與IGFBP6之間的相互作用尚需進(jìn)一步探索。這些研究結(jié)果可能為ORFV病毒控制以及預(yù)防治療提供新的疫苗和佐劑靶標(biāo),也有助于開(kāi)發(fā)對(duì)炎癥性疾病和癌癥有潛在的治療價(jià)值的藥物。
【關(guān)鍵詞】：羊胚胎鼻甲細(xì)胞 羊口瘡病毒 NF-κB信號(hào) ORFV024 酵母雙雜交
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R753.1
【目錄】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-14
• 前言14-18
• 第一章 羊胚胎鼻甲細(xì)胞的原代培養(yǎng)18-23
• 1 材料18
• 2 方法18-19
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果19-22
• 4 小結(jié)22-23
• 第二章 酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與ORFV024相互作用蛋白23-42
• 1 材料23-26
• 2 方法26-35
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-40
• 4 小結(jié)40-42
• 第三章 ORFV024宿主相互作用蛋白的鑒定42-59
• 1 材料42-43
• 2 方法43-48
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果48-58
• 4 小結(jié)58-59
• 第四章 討論59-65
• 參考文獻(xiàn)65-70
• 英漢縮略名詞對(duì)照70-72
• 碩士期間發(fā)表論文情況72-73
• 致謝73-75

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 鄭澤微;郝文波;羅樹(shù)紅;;痘病毒介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控[J];病毒學(xué)報(bào);2012年04期

2 羅燕雯,陳興芳,王玉智,馬愛(ài)榮,李平,高金梅;用犢牛睪丸細(xì)胞生產(chǎn)羊口瘡疫苗時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題[J];中國(guó)獸藥雜志;2003年07期

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本文編號(hào)：513210