發(fā)布時間：2017-07-03 10:06

  本文關(guān)鍵詞：羊口瘡病毒編碼的024蛋白調(diào)控NF-κB信號通路的分子機制

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【摘要】：羊傳染性膿皰病(Orf)又稱羊傳染性膿皰性皮炎,是由羊口瘡病毒(ORFV)引起的山羊和綿羊的一種急性、接觸性傳染病。易感羊群為3-6月齡的幼羊,多為群發(fā),而成羊發(fā)病多為散發(fā)。羊口瘡的典型特征是病羊口唇等處皮膚和黏膜形成紅斑、丘疹、膿瘡、潰瘍和結(jié)成疣狀厚痂。本病流行廣泛,世界各地均有發(fā)生,在我國北方、西北等羊群較多的地方比較常見,是羊的主要疫病之一。 羊口瘡病毒(ORFV)為雙鏈DNA病毒,屬痘病毒科,副痘病毒屬。ORFV基因組全長約135kb, G+C含量豐富(63%-64%),含131個預(yù)測基因。其中,病毒的基因組中部高度保守,在病毒復(fù)制和形態(tài)發(fā)生有重要作用,而兩端區(qū)域變異較大,多與病毒的毒性,致病及免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。 羊口瘡病毒(ORFV)被公認具有強大的宿主免疫調(diào)節(jié)功能。痘病毒對宿主的免疫調(diào)節(jié)作用主要是通過編碼大量的免疫調(diào)節(jié)蛋白作用于宿主免疫或炎癥反應(yīng)通路來實現(xiàn)的。NF-κB信號通路是病毒對宿主免疫調(diào)節(jié)的一個重要靶點,該通路在病毒感染宿主致病的過程中起關(guān)鍵作用。課題組的前期研究發(fā)現(xiàn),羊口瘡病毒的新基因ORFV024是一個病毒早期基因,呈點狀分布于細胞質(zhì)中,與NF-κB信號通路有關(guān),其編碼蛋白均能抑制NF-κB活化。 ORFV024雖然位于基因組中部,但與其它的痘病毒和細胞內(nèi)蛋白同源性較低,羊口瘡病毒不同毒株之間,以及羊口瘡病毒與其他副痘病毒之間比較,其序列的變異都是較大的。將基因缺陷株OV-IA82Δ024與野生株OV-IA82同時感染OFTu細胞中,發(fā)現(xiàn)0RFV024不影響病毒的復(fù)制,但是,OV-IA82Δ024卻可以明顯降低細胞病變效應(yīng)(CPE)。 ORFV024能抑制由NF-kappaB信號通路調(diào)節(jié)的細胞因子的升高,(IL-6,IL-8),抑制作用點位于NF-κB信號通路的上游,通過抑制IKKα和IKKβ的磷酸化來影響NF-kappaB信號通路。但是,系列實驗證實ORFV024與IKKα和IKKβ沒有直接的相互作用。所以O(shè)RFV024應(yīng)該是作用于IKKs上游的其它環(huán)節(jié),間接抑制IKKα和IKKβ的磷酸化。因此,本課題研究的目的是發(fā)現(xiàn)和驗證NF-kappaB信號通路中與ORFV024相互作用的蛋白,進一步明確ORFV024調(diào)控NF-κB信號通路的分子機制。 為保證整體實驗研究的順利進行,首先要解決羊口瘡病毒的大量培養(yǎng)問題。ORFV可在牛、羊的皮膚細胞、腎細胞以及犢牛和羔羊的睪丸細胞上生長,并產(chǎn)生細胞病變,但這些細胞獲取過程復(fù)雜,需要大量實驗動物,成為研究ORFV的一個重要問題。為此,我們建立了分離效率高、增殖快、操作簡單且可長期繼代的培養(yǎng)羊口瘡病病毒(ORFV)的原代細胞并進行了培養(yǎng)鑒定。首先是是羊胚胎鼻甲細胞的原代培養(yǎng),在孕羊的腹部及子宮做手術(shù)剖口,取出胚胎備用。無菌取羊胚胎的鼻甲部位,胰蛋白酶消化,稀釋成5×105個/ml的細胞接種液,100mm培養(yǎng)皿接種10ml細胞接種液,置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),利用倒置相差顯微鏡觀察細胞生長情況及形態(tài)變化。12h細胞已貼壁生長,呈梭形,72小時后細胞顯著增多。對其生長曲線測定,發(fā)現(xiàn)其倍增時間為36h。ORFV-NA株感染OFTu,24h后可形成典型的細胞病變效應(yīng)(CPE)。通過免疫熒光發(fā)現(xiàn),病毒接種12h后,即可以檢測到ORFV的增殖。12h內(nèi)為病毒對細胞的適應(yīng)期,病毒增殖緩慢；12-24h為病毒的快速增殖期,36-72h病毒效價增加緩慢。利用該細胞我們構(gòu)建了OFTu文庫,進行羊口瘡病病毒的增殖及其外源基因表達的研究。 篩選ORFV024的宿主相互作用蛋白,選用酵母雙雜交系統(tǒng),該系統(tǒng)在研究蛋白質(zhì)之間的相互作用中應(yīng)用廣泛。首先,利用上述建立的OFTu細胞構(gòu)建OFTucDNA文庫。提取OFTu RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,合成單缽cDNA,經(jīng)過PCR合成雙鏈cDNA,然后共轉(zhuǎn)化cDNA和線性pGADT-Rec載體到Y(jié)187酵母內(nèi),涂SD/-Leu平板,4-5天收取酵母克隆,加入到營養(yǎng)充足的液體培養(yǎng)基,分裝然后冷凍保存?zhèn)溆谩＝?jīng)鑒定,我們構(gòu)建了0.57ML,細胞密度為7.5×107/ml,滴度為8.3×106cfu/ml的OFTU cDNA文庫。然后,要構(gòu)建ORFV024誘餌質(zhì)粒載體,篩選OFTu細胞cDNA文庫并尋找病毒蛋白ORFV024與宿主蛋白之間相互作用靶分子。024基因被克隆入pGBKT7載體中,經(jīng)自激活及毒性實驗鑒定后,在酵母細胞中表達,然后與OFTu文庫融合,涂于缺乏亮氨酸及色氨酸的平板上初步篩選,挑取藍色克隆于更為嚴格的培養(yǎng)基,缺乏亮氨酸,色氨酸,組氨酸及腺嘌呤再次篩選。在嚴格培養(yǎng)基中挑取呈現(xiàn)深藍色斑的克隆,提取酵母質(zhì)粒并測序。經(jīng)篩選鑒定,共得到61個陽性克隆,通過DNA測序分析,其中包含11個蛋白序列。對11個序列蛋白都進行了生物信息學分析,發(fā)現(xiàn)其中兩個蛋白：IGFBP6(insulin-like growth factor binding protein6)和LAGE3(L antigen family, member3)與NF-KB通路相關(guān)。 進一步通過定位研究、His-Pull down實驗、免疫共沉淀實驗對ORFV-024與IGFBP6和LAGE3兩蛋白的相互作用進行鑒定。通過基因克隆技術(shù)構(gòu)建帶有GFP標簽的pEGFP-N1/IGFBP6和pEGFP-N1/LAGE3真核表達載體及帶有Flag標簽的pCDNA3.0-Flag/IGFBP6和pCDNA3.0-Flag/LAGE3,轉(zhuǎn)染OFTu細胞,觀察其定位,發(fā)現(xiàn)兩蛋白與ORFV024在細胞中分布一致,其中IGFBP6彌散分布于細胞質(zhì)中,而LAGE3分布于整個細胞中。將構(gòu)建好的pCDNA3.0-Flag/IGFBP6和pCDNA3.0-Flag/LAGE3與pEGFP-N1/OFRV024共同轉(zhuǎn)入OFTu細胞中,經(jīng)過細胞免疫熒光染色后進行激光共聚焦分析,發(fā)現(xiàn)在OFTu細胞中,ORFV024與IGFBP6和LAGE3之間有空間上的重疊,提示可能具有相互作用。 隨后進行了His-Pull down實驗�；蚩寺〖夹g(shù)構(gòu)建pET32a/ORFV024原核表達載體,表達純化,復(fù)性后,與His親和凝膠結(jié)合2h,再分別對pEGFP-N1/IGFBP6和pEGFP-N1/LAGE3及pCDNA3.0-Flag/IGFBP6和pCDN A3.0-Flag/L AGE3真核表達蛋白進行Pull down, Western blot結(jié)果表明,024-HIS能與真核表達的LAGE3-GFP、LAGE3-Flag相互作用,但未觀察到ORFV024與IGFBP6間的相互作用。Co-IP觀察到相似的結(jié)果。293T細胞共轉(zhuǎn)染pCMVTAG4A-024和LAGE3-GFP或IGFBP6-GFP或GFP,轉(zhuǎn)染24h收細胞裂解,細胞裂解物用抗Flag抗體進行免疫共沉淀,細胞裂解物及免疫沉淀后樣品進行SDS-PAGE電泳,再用抗GFP抗體進行Western blot分析,可見LAGE3-GFP與024-FLAG有相互作用,但IGFBP6-GFP與024-FLAG未觀察到相互作用。 綜上所述,本課題成功建立了分離效率高、增殖快、操作簡單且可長期繼代的培養(yǎng)羊口瘡病病毒(ORFV)的羊胚胎鼻甲細胞原代細胞,為羊口瘡病毒的體外增值和致病機制的研究奠定了基礎(chǔ)；成功構(gòu)建了OFTu cDNA文庫,為后續(xù)ORFV相互作用蛋白的研究提供了條件；篩選鑒定了ORFV024相互作用的宿主蛋白。采用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選獲得11個基因序列,其中IGFBP6和LAGE3與NF-κB信號通路相關(guān)。通過激光共聚焦、His-Pull down、Co-IP試驗證實ORFV024與LAGE3之間存在相互作用,ORFV024與IGFBP6之間的相互作用尚需進一步探索。這些研究結(jié)果可能為ORFV病毒控制以及預(yù)防治療提供新的疫苗和佐劑靶標,也有助于開發(fā)對炎癥性疾病和癌癥有潛在的治療價值的藥物。
【關(guān)鍵詞】：羊胚胎鼻甲細胞 羊口瘡病毒 NF-κB信號 ORFV024 酵母雙雜交
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R753.1
【目錄】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-14
• 前言14-18
• 第一章 羊胚胎鼻甲細胞的原代培養(yǎng)18-23
• 1 材料18
• 2 方法18-19
• 3 實驗結(jié)果19-22
• 4 小結(jié)22-23
• 第二章 酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與ORFV024相互作用蛋白23-42
• 1 材料23-26
• 2 方法26-35
• 3 實驗結(jié)果35-40
• 4 小結(jié)40-42
• 第三章 ORFV024宿主相互作用蛋白的鑒定42-59
• 1 材料42-43
• 2 方法43-48
• 3 實驗結(jié)果48-58
• 4 小結(jié)58-59
• 第四章 討論59-65
• 參考文獻65-70
• 英漢縮略名詞對照70-72
• 碩士期間發(fā)表論文情況72-73
• 致謝73-75

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 鄭澤微;郝文波;羅樹紅;;痘病毒介導(dǎo)的NF-κB信號通路的調(diào)控[J];病毒學報;2012年04期

2 羅燕雯,陳興芳,王玉智,馬愛榮,李平,高金梅;用犢牛睪丸細胞生產(chǎn)羊口瘡疫苗時應(yīng)注意的問題[J];中國獸藥雜志;2003年07期

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本文編號：513210