本文關(guān)鍵詞：IFN-γ或IP-10培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞和銀屑病皮損的特點(diǎn)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《鄭州大學(xué)》 2013年

IFN-γ或IP-10培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞和銀屑病皮損的特點(diǎn)

張利勤  

【摘要】：銀屑病是一種臨床常見(jiàn)的、原因不明的慢性炎癥性皮膚病。其發(fā)生、發(fā)展過(guò)程是需要多種趨化因子的共同參與,與遺傳的內(nèi)因和外環(huán)境的感染,營(yíng)養(yǎng),精神狀態(tài)等外因有關(guān),屬于患者較多自體免疫疾病,且易反復(fù)發(fā)作。目前研究認(rèn)為,銀屑病是與Thl型細(xì)胞相關(guān)的免疫紊亂性疾病。γ-干擾素(interferon-γ,IFN-γ)誘導(dǎo)蛋白10(IP-10)是CXCL家族趨化因子之一,又名CXCL趨化因子配體10,是由IFN-γ所誘導(dǎo)產(chǎn)生的可趨化淋巴細(xì)胞等的分子量為10kDa蛋白質(zhì)。P-10不僅具有強(qiáng)大的招募中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的功能,還能促進(jìn)多種細(xì)胞釋放炎癥因子,亦可促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增生,能作為趨化因子介導(dǎo)Thl型炎癥反應(yīng)。IP-10在銀屑病患者的皮損中表達(dá)持續(xù)上調(diào),經(jīng)過(guò)成功治療后IP-10表達(dá)減少。IP-10可促進(jìn)銀屑病皮損的發(fā)生及發(fā)展。銀屑病的發(fā)病與IFN-γ有重要關(guān)系,在銀屑病患者的血清及角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ濃度均明顯高于正常人。在皮膚免疫中IFN-γ對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的增生與凋亡有重要影響,它促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增生,IFN-γ在角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖中發(fā)揮關(guān)鍵作用。 近年研究發(fā)現(xiàn)各種疾病既與基因?qū)W,也與表觀遺傳學(xué)的改變有關(guān)。表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制在自身免疫性疾病及腫瘤的發(fā)展中起到重要的作用,表觀遺傳學(xué)參與了銀屑病發(fā)病機(jī)制,具體在銀屑病的發(fā)病機(jī)制中尚不十分清楚。表觀遺傳學(xué)主要包括基因的DNA甲基化；組蛋白的修飾以及小分子RNA調(diào)控。表觀遺傳學(xué)的改變,雖不改變ATCG的序列,卻影響基因的轉(zhuǎn)錄,增殖,分化,凋亡等細(xì)胞過(guò)程。HaCaT細(xì)胞為永生化角質(zhì)形成細(xì)胞,為研究抗銀屑病藥物活性的常用細(xì)胞株。本實(shí)驗(yàn)研究通過(guò)應(yīng)用IP-10與IFN-γ分別誘導(dǎo)人HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞,觀察作用后對(duì)HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞表觀遺傳學(xué)的改變以及對(duì)增殖與炎癥的影響,并與銀屑病患者皮損組織的病變特征作對(duì)比。初步揭示了IP-10與IFN-γ對(duì)于人HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞的作用,模擬了銀屑病的皮損組織特點(diǎn),探討IP-10/IFN-γ對(duì)銀屑病發(fā)生和發(fā)展中的作用。 目的 1.觀察IP-10與IFN-γ分別對(duì)HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)的改變及對(duì)增殖與炎癥的影響。 2.銀屑病患者皮損組織與正常組織作對(duì)比,探討銀屑病表觀遺傳學(xué)的改變,對(duì)增殖與炎癥因子的變化。IP-10與IFN-γ分別對(duì)HaCaT的特點(diǎn)與銀屑病皮損相比較,說(shuō)明IP-10/IFN-γ對(duì)銀屑病發(fā)生和發(fā)展中的作用。 材料與方法： 臨床資料 收集我院2011年10月至2012年4月皮膚門(mén)診尋常性銀屑病患者皮損20例,均經(jīng)組織病理學(xué)確診。以及收集我院2012年1月至2月泌尿外科包皮切除患者20例。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者均簽署知情同意書(shū)。 角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT株凍存于鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子細(xì)胞生物學(xué)研究中心 方法 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本分為細(xì)胞與組織兩大組 1)細(xì)胞：IP-10(20ng/ml)組；IFN-γ (50u/L)組及對(duì)照(C)組 2)組織：銀屑病皮損組和正常對(duì)照組 1.免疫印跡 1)細(xì)胞 應(yīng)用CelLyticTM提取蛋白質(zhì),考馬斯亮藍(lán)G-250檢測(cè)蛋白濃度并進(jìn)行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,對(duì)DNMT1, NF-κBp65, HDAC1, Cyclin D1, IL-6及P16(以β-actin作為內(nèi)參照)進(jìn)行免疫印跡定性及半定量檢測(cè)。 1)組織 用勻漿器將組織研碎,應(yīng)用CelLyticTM提取蛋白質(zhì),考馬斯亮藍(lán)G-250檢測(cè)蛋白濃度并進(jìn)行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,對(duì)DNMT1, NF-κBp65, HDAC1, Cyclin D1,IL-6及P16(以β-actin作為內(nèi)參照)進(jìn)行免疫印跡定性及半定量檢測(cè)。 2.免疫化學(xué)染色 1)細(xì)胞 各標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛中固定,吹干及透化,應(yīng)用SP試劑盒,檢測(cè)NF-κB及IL-6的表達(dá)。同時(shí)進(jìn)行以PBS替代一抗的陰性對(duì)照。 2)組織 各組織標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛中固定,按常規(guī)脫水、透明并行石蠟包埋切片。在石蠟入水過(guò)程中,用0.3%H202處理以抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶(HRP),用5mM左旋咪唑處理以抑制外源性堿性磷酸酶(AP)后,應(yīng)用NF-κB鼠單抗,IL-6兔多抗對(duì)皮損組及正常對(duì)照組進(jìn)行以NF-κB, IL-6以AEC酶為底物的免疫組織化學(xué)染色。正常血清封閉,,4℃孵育過(guò)夜,先進(jìn)行AEC染色后,再進(jìn)行多抗的NBT-BCIP染色,DAB顯色并終止。同時(shí)進(jìn)行以PBS替代一抗的陰性對(duì)照。 3.MSP甲基化特異PCR應(yīng)用TIANamp Genomic DNA Kit進(jìn)行各細(xì)胞及組織標(biāo)本的基因組DNA的提取。然后應(yīng)用MethylampTM DNA Modification Kit進(jìn)行各基因組DNA甲基化。甲基化特異的p16基因引物及未甲基化特異性的p16基因引物進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增。DNA電泳檢測(cè)目的產(chǎn)物。 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。應(yīng)用圖像分析儀掃描各圖像的條帶灰度,各細(xì)胞與組織化學(xué)染色及MSP條帶的信號(hào)值,各免疫印跡數(shù)值為各主帶掃描灰度均值與其各β-actin掃描灰度均值的比值。正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±S)表示,以單因素方差進(jìn)行分析比較,a=0.05為顯著性水準(zhǔn)。 結(jié)果 1.免疫印跡 1)細(xì)胞 與對(duì)照組相比,DNMT1(180kDa), NF-κBP65(65kDa), HDAC1(60kDa), CyclinD1(36kDa), IL-6(23kDa)及P16(16kDa)的免疫信號(hào)。IP-10組、IFN-γ組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 2)組織 與對(duì)照組相比,DNMT1(180kDa), NF-κBp65(65kDa), HDAC1(60kDa), CyclinD1(36kDa), IL-6(23kDa)及P16(16kDa)的免疫信號(hào)。銀屑病患者皮損組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 2.免疫染色 1)細(xì)胞 與對(duì)照組相比,IP-I0組的NF-κB和IL-6胞核陽(yáng)性表達(dá)均增強(qiáng),差異顯著(P0.01)。IFN-γ組的NF-κB和IL-6胞核陽(yáng)性表達(dá)均增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 2)組織 與正常組織相比,皮損組織表皮增殖旺盛,棘細(xì)胞體積增大,層次增多,可見(jiàn)胞核呈陽(yáng)性信號(hào)；皮損組NF-κB與IL-6的表達(dá)明顯高于正常組(P0.01)。 3.MSP 1)細(xì)胞 與對(duì)照組相比,IP-10組、IFN-γ組的甲基化P16表達(dá)較高,非甲基化P16表達(dá)較低,差異具有顯著性P0.05)。 2)組織 與正常組織相比,銀屑病皮損組織甲基化P16表達(dá)較高,非甲基化P16表達(dá)較低,差異具有顯著性P0.05)。 結(jié)論 1.免疫印跡顯示DNMT1和HDAC1在IP-10/IFN-γ細(xì)胞組和皮損組織的表達(dá)均高于相應(yīng)對(duì)照組,提示IP-10/IFN-γ細(xì)胞組和皮損組織皆可能存在表觀遺傳學(xué)的改變。 2. IP-10/IFN-γ細(xì)胞組與銀屑病皮損組織中,Cyclin D1, NF-κBp65和IL-6的免疫印跡及免疫染色的表達(dá)均顯著增高,并且P16免疫印跡信號(hào)下調(diào),提示IP-10/IFN-γ誘導(dǎo)了細(xì)胞的增殖與炎癥反應(yīng)。 3.MSP顯示IP-10/IFN-γ細(xì)胞組與銀屑病皮損組織中的P16甲基化水平皆高于相應(yīng)對(duì)照組,而非甲基化則明顯下降,低于甲基化。 4.IP-10與IFN-γ通過(guò)表觀遺傳學(xué)的改變,顯著提高HaCaT細(xì)胞的增殖及炎癥因子,此與銀屑病皮損組織特點(diǎn)類(lèi)似。提示IP-10與IFN-γ參與了銀屑病的發(fā)生機(jī)制與發(fā)展,可得出以IP-10/IFN-γ培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞模擬了銀屑病的特點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R758.63
【目錄】：

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5 史曉蔚;王剛;劉玉峰;;銀屑病的研究進(jìn)展[A];2009全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2009年

6 鄭敏;;銀屑病的發(fā)病機(jī)制和治療的最新進(jìn)展[A];2009全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2009年

7 孫虹;;中西醫(yī)結(jié)合治療銀屑病的現(xiàn)狀與展望[A];中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)皮膚科分會(huì)學(xué)術(shù)會(huì)議、全國(guó)中醫(yī)藥防治皮膚病成果與技術(shù)交流大會(huì)、全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚科治療新技術(shù)臨床推廣應(yīng)用高級(jí)研修班文獻(xiàn)匯編[C];2004年

8 何弘;;銀屑病皮損手術(shù)切口愈合情況臨床觀察與初探[A];中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)皮膚科分會(huì)第四次學(xué)術(shù)年會(huì);全國(guó)中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合皮膚病診療新進(jìn)展高級(jí)研修班論文集[C];2007年

9 吳夢(mèng)平;;銀屑病發(fā)病與難治原因探討[A];中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)皮膚科分會(huì)第五次學(xué)術(shù)年會(huì);全國(guó)中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合皮膚病診療新進(jìn)展高級(jí)研修班論文集[C];2008年

10 鄭敏;;銀屑病的發(fā)病機(jī)制和治療的最新進(jìn)展[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十五次全國(guó)皮膚性病學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2009年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 山西中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 張英棟;[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2012年

2 記者 田雅婷;[N];光明日?qǐng)?bào);2012年

3 胡雯 劉佳;[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2013年

4 本報(bào)記者 白軼南;[N];保健時(shí)報(bào);2005年

5 湖南中醫(yī)學(xué)院附二院主任醫(yī)師 歐陽(yáng)恒;[N];大眾衛(wèi)生報(bào);2002年

6 山東省威海市解放軍404醫(yī)院皮膚科 歐柏生;[N];大眾衛(wèi)生報(bào);2005年

7 ;[N];河北日?qǐng)?bào);2000年

8 歐柏生;[N];健康報(bào);2004年

9 鄒先彪;[N];健康報(bào);2005年

10 召玉;[N];經(jīng)濟(jì)日?qǐng)?bào).農(nóng)村版;2005年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 楊海平;銀屑病激發(fā)因素的調(diào)查與防治對(duì)策的研究[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);1999年

2 徐麗敏;銀屑病細(xì)胞因子異常表達(dá)及相關(guān)藥物的研究[D];天津大學(xué);2007年

3 陳靜;銀屑病患者皮損和外周血中漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞，TLR9、IRF-7、IFN-αmRNA表達(dá)研究[D];華中科技大學(xué);2008年

4 高春芳;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子βs及受體在銀屑病皮損和外周血中的表達(dá)與意義[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2001年

5 唐玲;銀屑病患者朗格漢斯細(xì)胞異常機(jī)制的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2001年

6 李波;銀屑病與腫瘤壞死因子基因多態(tài)性相關(guān)研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2002年

7 陳小紅;β-溶血性鏈球菌、結(jié)核分支桿菌與銀屑病相關(guān)性研究[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2002年

8 孫聯(lián)文;抗銀屑病相關(guān)藥物及化合物對(duì)花生四烯酸系統(tǒng)中5-脂氧合酶代謝途徑的影響[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2001年

9 李鈾;銀屑病患者心身狀態(tài)研究及新醫(yī)學(xué)模式的治療探索[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2006年

10 樊昕;白細(xì)胞介素18對(duì)銀屑病T細(xì)胞趨化因子受體7表達(dá)調(diào)控的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2006年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 周愔;銀屑病患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)活性的研究[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2009年

2 何君;9q33-34區(qū)域單核苷酸多態(tài)性與漢族人銀屑病易感性相關(guān)研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2009年

3 蘇湘川;銀屑病患者腸粘膜通透性及病情與飲食相關(guān)性的研究[D];蘭州大學(xué);2010年

4 姚莎;中國(guó)漢族人銀屑病伴發(fā)疾病分析[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2010年

5 張永翠;銀屑病患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的初步研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2011年

6 詹慶霞;銀屑病治療的系統(tǒng)評(píng)價(jià)[D];天津醫(yī)科大學(xué);2005年

7 李敬;細(xì)胞粘附分子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子與銀屑病相關(guān)研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2005年

8 孫湘蘭;白細(xì)胞介素20及其受體在銀屑病患者外周血中表達(dá)的研究[D];蘇州大學(xué);2004年

9 韓靜倩;內(nèi)毒素及其信號(hào)傳導(dǎo)通路與銀屑病的相關(guān)研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2006年

10 史曉蔚;特異性置換肽對(duì)銀屑病動(dòng)物模型作用的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2006年

  本文關(guān)鍵詞：IFN-γ或IP-10培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞和銀屑病皮損的特點(diǎn)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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