本文關(guān)鍵詞：鎂通過調(diào)節(jié)鈣化相關(guān)因子的表達(dá)抑制血管鈣化

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【摘要】：目的:血管鈣化是慢性腎臟病(CKD)患者的常見并發(fā)癥,與心血管疾病(CVD)死亡率密切相關(guān)。眾所周知除傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素,非傳統(tǒng)因素,如尿毒癥毒素、礦物質(zhì)代謝紊亂,尤其是高磷血癥,在血管鈣化的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。其中高磷可通過很多途徑誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)發(fā)生鈣化,如血管平滑肌細(xì)胞凋亡、骨源性分化、鈣化促進(jìn)因子(如:核心結(jié)合因子α-1)及抑制因子(如:基質(zhì)G蛋白;骨橋蛋白質(zhì))的平衡紊亂等。因此由于血管鈣化發(fā)生的機(jī)制十分復(fù)雜,致使目前對血管鈣化尚無有效的預(yù)防和治療方法。鎂離子作為體內(nèi)重要的陽離子對維持血管彈性和心臟節(jié)律有重要的作用,因此近年來鎂離子與血管鈣化之間的關(guān)系備受關(guān)注,有臨床研究發(fā)現(xiàn)碳酸鎂可能會抑制冠狀動脈鈣化的進(jìn)展,但鎂離子和血管鈣化之間的確切關(guān)系目前尚不完全明確,因此本研究旨在探討增加鎂離子濃度后對高磷誘導(dǎo)血管鈣化的影響及其可能的機(jī)制。方法:1 VSMCs原代培養(yǎng)取5周齡雄性健康SD大鼠胸主動脈通過組織貼壁法進(jìn)行VSMCs原代培養(yǎng),應(yīng)用形態(tài)學(xué)和免疫學(xué)方法進(jìn)行平滑肌細(xì)胞鑒定。2實(shí)驗(yàn)干預(yù)及分組隨機(jī)將VSMCs分為4組:(1)正常對照組:加入10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基;(2)高磷組:正常培基中加入10 mmol/Lβ-甘油磷酸(β-GP);(3)鎂干預(yù)組:在高磷培基中加入3 mmol/L硫酸鎂(Mg SO4);(4)鎂通道抑制劑(2-APB)干預(yù)組:高磷培基中加入3 mmol/L Mg SO4及10-4 mol/L 2-APB。各組VSMCs分別培養(yǎng)0、3、6、10、14天。3在培養(yǎng)14天后測定各組VSMCs的鈣化水平各組VSMCs的鈣化染色應(yīng)用茜素紅(Alizarin red stain)方法;各組VSMCs鈣含量測定應(yīng)用鄰甲酚酞絡(luò)合酮比色法。4在培養(yǎng)14天后測定各組VSMCs的堿性磷酸酶(ALP)活性將各組VSMCs培養(yǎng)14天后棄去其上清液,依據(jù)ALP活性試劑盒測定ALP活性,此過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。5在不同時(shí)間點(diǎn)測定各組VSMCs核心結(jié)合因子α-1(Cbfα1)m RNA的表達(dá)應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR分別檢測0天、3天、6天、10天、14天時(shí)正常對照組、高磷組、鎂干預(yù)組以及14天時(shí)鎂通道抑制劑干預(yù)組Cbfα1 m RNA的表達(dá)。6在不同時(shí)間點(diǎn)分別檢測各組VSMCs中基質(zhì)G蛋白(MGP)m RNA和骨橋蛋白質(zhì)(OPN)m RNA的表達(dá)。應(yīng)用RT-PCR分別檢測0天、3天、6天、10天、14天時(shí)正常對照組、高磷組、鎂干預(yù)組以及14天時(shí)鎂通道抑制劑干預(yù)組VSMCs MGP m RNA和OPN m RNA的表達(dá)。7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間均數(shù)差異比較應(yīng)用單因素方差分析(ANOVA),組間均數(shù)兩兩比較應(yīng)用SNK檢驗(yàn),P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1大鼠VSMCs的原代培養(yǎng)大鼠原代VSMCs采用組織塊貼壁法獲得,一般情況下動脈組織塊貼壁后約3~4天即可爬出少量細(xì)胞,細(xì)胞形狀主要為長梭形,并以束狀形式排列,組織塊貼壁6-7天后細(xì)胞融合成片,細(xì)胞形狀仍以梭形為主。當(dāng)細(xì)胞處于亞融合狀態(tài)時(shí)即可傳代,傳代后的細(xì)胞開始為橢圓形或者圓形,待細(xì)胞貼壁后可逐漸伸展為梭形,細(xì)胞漿豐富,細(xì)胞核呈圓形或者卵圓形,細(xì)胞重疊生長,呈現(xiàn)出“峰-谷”樣。α-平滑肌肌動蛋白抗體(α-SMA actin)是血管平滑肌細(xì)胞特異性抗體,免疫學(xué)方法檢測的陽性結(jié)果為平滑肌細(xì)胞胞漿內(nèi)強(qiáng)表達(dá)α-SMA actin,胞漿內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色。2高鎂抑制高磷誘導(dǎo)的VSMCs鈣化及ALP活性各組VSMCs鈣化染色結(jié)果:與正常對照組相比,高磷組可見大量橘紅色鈣鹽沉積;與高磷組相比,鎂干預(yù)組細(xì)胞鈣鹽沉積明顯減輕,鎂通道抑制劑干預(yù)組鈣鹽沉積比鎂干預(yù)組明顯增加。與鈣化染色相一致,鈣含量測定結(jié)果顯示鎂干預(yù)組明顯降低高磷誘導(dǎo)的鈣鹽沉積(P0.05),而這種作用可被2-APB抑制(P0.05)。ALP活性測定結(jié)果顯示:鎂干預(yù)組ALP活性明顯低于高磷組及鎂通道抑制劑干預(yù)組(P0.05)。3高鎂抑制高磷誘導(dǎo)的VSMCs中骨源性因子Cbfα1的表達(dá),并呈時(shí)間依賴性RT-PCR結(jié)果顯示,培養(yǎng)14天后,鎂干預(yù)組Cbfα1的水平明顯低于高磷組及鎂通道抑制劑干預(yù)組(P0.05)。且動態(tài)觀察Cbfα1的表達(dá)變化發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)第3天時(shí),高磷組Cbfα1表達(dá)即明顯增加(P0.05),并隨著時(shí)間的延長呈上升趨勢;而高鎂在第3天時(shí)即明顯抑制了Cbfα1表達(dá),長期培養(yǎng)過程中其抑制效果逐漸增強(qiáng)。4高鎂可上調(diào)鈣化相關(guān)抑制因子MGP和OPN的表達(dá),并呈時(shí)間依賴性RT-PCR結(jié)果顯示,培養(yǎng)14天后,鎂干預(yù)組MGP m RNA和OPN m RNA的表達(dá)水平高于高磷組及鎂通道抑制劑干預(yù)組(P0.05)。動態(tài)觀察MGP m RNA和OPN m RNA的表達(dá)變化,結(jié)果顯示在培養(yǎng)第3天時(shí),高磷組MGP m RNA和OPN m RNA表達(dá)水平均降低(P0.05),并隨著時(shí)間的延長呈下降趨勢;在培養(yǎng)第3天時(shí),高鎂抑制了高磷誘導(dǎo)的MGP m RNA和OPN m RNA表達(dá)下降的作用(P0.05),且長期(14天)暴露在高鎂環(huán)境中可逐漸增加MGP和OPN的表達(dá)。結(jié)論:1高濃度鎂離子可抑制高磷誘導(dǎo)的VSMCs鈣化。2高濃度鎂離子抑制VSMCs鈣化的機(jī)制可能是通過降低Cbfα1的表達(dá)抑制VSMCs表型轉(zhuǎn)化,并上調(diào)內(nèi)源性鈣化相關(guān)拮抗因子MGP及OPN的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的,且此過程呈一定的時(shí)間依賴性。
【關(guān)鍵詞】：鈣化 β-甘油磷酸 血管平滑肌肌細(xì)胞 鎂 核心結(jié)合因子α-1 基質(zhì)G蛋白 骨橋蛋白質(zhì) 時(shí)間依賴性
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R692
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文縮寫11-12
• 前言12-14
• 材料與方法14-22
• 結(jié)果22-24
• 附圖24-28
• 附表28-29
• 討論29-32
• 結(jié)論32-33
• 參考文獻(xiàn)33-35
• 綜述 鎂在慢性腎臟病血管鈣化中的作用35-44
• 參考文獻(xiàn)40-44
• 致謝44-45
• 個(gè)人簡歷45

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