本文關(guān)鍵詞：移植腎急性排斥反應(yīng)血漿MicroRNA表達譜篩查

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【摘要】：[背景]腎移植目前已成為治療終末期腎病(End-Stage Renal Disease, ESRD)的有效手段,隨著新型免疫抑制劑的不斷研發(fā),加之組織配型技術(shù)的日漸成熟,移植腎存活率不斷提高,遠期療效逐漸改善,但術(shù)后排斥反應(yīng)的發(fā)生仍然是導致慢性移植腎功能不全(Chronic Renal Allograft Dysfunction, CRAD)的重要因素,其中急性排斥反應(yīng)(Acute Rejection, AR)被認為是引起CRAD的主要免疫性危險因素,這使得AR的早期診斷及治療變得尤為重要。目前臨床診斷AR的金標準為移植腎穿刺活檢(needle-core biopsy, NCB),雖然活檢并發(fā)癥的發(fā)生率較低,但其畢竟為有創(chuàng)檢查,且可能需多次穿刺才能符合AR的病理診斷標準,同時由于抽樣誤差、不同病理醫(yī)師間診斷水平參差不齊等因素的影響,均可能增加誤診的風險。因此,臨床上迫切需要從腎移植受者的血液或尿液中,無創(chuàng)檢測出一種具有高敏感性、高特異性及可重復性強等特點的生物學標記物,要求其能夠反應(yīng)腎移植受者機體的免疫狀態(tài),并能輔助臨床醫(yī)生明確診斷AR。MicroRNA是一類在人體內(nèi)廣泛分布的內(nèi)源性非編碼小分子單鏈RNA,通常由18-22個核苷酸組成。研究表明miRNA廣泛參與細胞生理活動的各個環(huán)節(jié),并影響機體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié),其異常表達被證明與多種疾病進程密切相關(guān)。同時,由于miRNA存在于體液中的外泌體(exsomes)內(nèi),可幫助其抵御RNA酶的降解,致使血漿中的miRNA得以穩(wěn)定存在。因此研究認為,外周血miRNA有可能成為理想的新型疾病分子標記物。目前已有多項研究表明miRNA與腎移植術(shù)后發(fā)生AR相關(guān),但由于樣本來源、檢測方法、對照組選擇等因素的不同,各研究實驗結(jié)果并不完全相符,甚至存在相互矛盾的現(xiàn)象。本實驗利用高通量miRNA芯片檢測技術(shù),篩選出腎移植AR患者血漿中miRNA的特異性表達譜,并采用獨立樣本通過實時熒光定量PCR(RT-qPCR)技術(shù)對芯片結(jié)果進行驗證,以期尋找可穩(wěn)定于血漿中檢測到的、與腎移植AR發(fā)生密切相關(guān)的miRNA,作為診斷AR的新型生物學標記物用于臨床。[目的]擬通過microRNA芯片高通量分析可能與腎移植急性排斥反應(yīng)發(fā)生相關(guān)的microRNA標志物,并采用獨立樣本通過實時熒光定量PCR (RT-qPCR)技術(shù)驗證芯片檢測結(jié)果,為后續(xù)研究腎移植急性排斥反應(yīng)發(fā)生機制提供理論及數(shù)據(jù)依據(jù),為臨床無創(chuàng)診斷腎移植急性排斥反應(yīng)尋找可能的新型生物學標記物。[方法]1.腎移植急性排斥反應(yīng)發(fā)生相關(guān)的microRNA標記物篩選1.1實驗分組：獲取3例腎移植術(shù)后發(fā)生AR患者的血漿,歸為AR組；獲取3例同期行腎移植術(shù),但未發(fā)生AR患者的血漿,歸為非AR組。1.2指標檢測：microRNA芯片分別檢測兩組血漿樣本microRNA表達情況。1.3數(shù)據(jù)分析：使用Agilent Feature Extraction(v10.7)軟件對雜交圖片進行分析并提取數(shù)據(jù),使用Agilent GeneSpring軟件對數(shù)據(jù)進行歸一化和差異分析,獲得兩組樣本各自microRNA表達譜以及兩組間microRNA的差異表達情況。2.腎移植急性排斥反應(yīng)發(fā)生相關(guān)的microRNA臨床驗證2.1實驗分組：獲取10例腎移植術(shù)后發(fā)生AR患者的血漿,歸為AR組；獲取10例同期行腎移植術(shù),但未發(fā)生AR患者的血漿,歸為非AR組；獲取10例健康成人的血漿,歸為正常對照組。2.2指標檢測：結(jié)合芯片實驗結(jié)果及相關(guān)文獻報道,通過RT-qPCR方法分別檢測各組血漿樣本中miR-142-5p、miR-144-5p及miR-130a-3p的表達情況。2.3數(shù)據(jù)分析:采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理,多組計量資料的比較使用單因素方差分析,兩兩比較使用q檢驗；兩組計量資料的比較使用獨立樣本的t檢驗,計量資料使用x±s表示。p0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。[結(jié)果]1.芯片實驗結(jié)果顯示：1.1腎移植AR組與非AR組間,共有20個表達差異顯著(P0.05)的miRNA;1.2在20個表達差異顯著的miRNA中13個表達顯著上調(diào),分別為：hsa-miR-142-5p、hsa-miR-144-5p、hsa-miR-363-3p、hsa-miR-130a-3p、 hsa-miR-24-3p、hsa-miR-101-3p、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-4286、hsa-miR-3135b、 hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-30e-5p、hsa-miR-18a-5p、hsa-miR-574-5p;1.3在20個表達差異顯著的miRNA中7個miRNA表達顯著下調(diào),分別為：hsa-miR-6854-5p、hsa-miR-4694-5p、hsa-miR-559、hsa-miR-8064、hsa-miR-645、 hsa-miR-7108-5p、hsa-miR-6727-5p。2.實時熒光定量PCR實驗結(jié)果：與非AR組及正常對照組相比,AR組血漿樣本中miR-142-5p、miR-144-5p及miR-130a-3p的表達顯著上調(diào),差異具有統(tǒng)計學意義(P0.001),并與芯片檢測結(jié)果相一致。[結(jié)論]1.利用微陣列芯片技術(shù)進行篩選,結(jié)合定量PCR技術(shù)進行驗證的實驗方法,是篩選腎移植AR發(fā)生相關(guān)miRNA的有效研究手段。2.相比非AR組及正常對照組,AR組中miR-142-5p、miR-144-5p及miR-130a-3p表達顯著上調(diào),以上3個miRNA可能與腎移植急性排斥反應(yīng)的發(fā)生有關(guān)。3.AR組患者與非AR組患者相比,血漿中共有20個miRNA表達具有差異,其中13個表達上調(diào),7個表達下調(diào),這些表達差異可作為進一步篩選AR發(fā)生相關(guān)miRNA的數(shù)據(jù)依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：microRNA 腎移植 急性排斥反應(yīng) 微陣列分析 聚合酶鏈反應(yīng)
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R699.2
【目錄】：

• 縮略詞表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-12
• 前言12-15
• 材料與方法15-26
• 1 腎移植急性排斥反應(yīng)發(fā)生相關(guān)的microRNA標記物篩選15-20
• 1.1 實驗材料15-17
• 1.2 實驗方法17-20
• 2 腎移植急性排斥反應(yīng)發(fā)生相關(guān)的microRNA臨床驗證20-26
• 2.1 實驗材料20-21
• 2.2 實驗方法21-26
• 結(jié)果26-33
• 1 芯片實驗結(jié)果26-28
• 2 實時熒光定量PCR檢測miRNA結(jié)果28-33
• 討論33-38
• 結(jié)論38-39
• 參考文獻39-42
• 綜述42-49
• 參考文獻47-49
• 攻讀學位期問獲得的學術(shù)成果49-50
• 致謝50

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