本文關(guān)鍵詞：細(xì)胞粘附分子1對(duì)膀胱癌增殖侵襲的影響及其機(jī)制研究

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【摘要】：目的:我們前期研究發(fā)現(xiàn)CADM1/TSLC1在膀胱尿路上皮癌中表達(dá)降低甚至缺失,且與病理分級(jí)呈負(fù)相關(guān)。為進(jìn)一步探討CADM1在膀胱尿路上皮癌中表達(dá)降低的機(jī)制,并探討CADM1過(guò)表達(dá)后對(duì)膀胱癌細(xì)胞系細(xì)胞增殖、侵襲、及凋亡的影響,為闡明CADM1基因在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的功能及其可能機(jī)制奠定研究基礎(chǔ)。方法:1、甲基化特異性PCR技術(shù)(MSP)檢測(cè)84例膀胱尿路上皮癌中CADM1基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài),同時(shí)選取20例正常膀胱黏膜組織作為對(duì)照;WB檢測(cè)CADM1蛋白表達(dá)情況,分析CADM1基因啟動(dòng)子CpG島甲基化狀態(tài)與臨床病理參數(shù)和蛋白表達(dá)量之間的關(guān)系。2、構(gòu)建CADM1過(guò)表達(dá)和干擾慢病毒載體并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人膀胱癌T24細(xì)胞系,獲得Ad-CADM1-T24,Ad-GFP1-T24,Ad-sh RNA-T24,Ad-GFP2-T24(AdGFP1-T24和Ad-GFP2-T24分別為過(guò)表達(dá)和干擾對(duì)應(yīng)載體轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞系),RT-PCR和WB驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率;甲基化抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷(5-Aza-CdR)處理T24細(xì)胞系,獲得5-Aza-CdR-T24。3、WB檢測(cè)Ad-CADM1-T24,Ad-GFP1-T24,Ad-sh1-T24,Ad-GFP2-T24,5-Aza-CdR-T24,T24共6種細(xì)胞株凋亡相關(guān)蛋白(caspase-3,bcl-2,bax)、EMT標(biāo)記物(E-cadherin,β-catenin,Vimentin)、細(xì)胞周期相關(guān)蛋白(p27,cyclinD1,cyclinE1,CDK2)的表達(dá)情況。4、MTT法測(cè)定Ad-CADM1-T24,Ad-GFP1-T24,Ad-sh1-T24,Ad-GFP2-T24,5-Aza-Cd R-T24,T24共6種細(xì)胞株細(xì)胞增殖能力;Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)上述6種細(xì)胞株細(xì)胞侵襲能力;流式細(xì)胞儀檢測(cè)上述6種細(xì)胞株細(xì)胞周期變化。結(jié)果:1、20例正常膀胱黏膜組織中均未檢測(cè)到CADM1基因甲基化,84例膀胱尿路上皮癌組織中43例檢測(cè)到CADM1啟動(dòng)子區(qū)甲基化,甲基化率為51.2%(43/84),兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);膀胱癌組織中CADM1基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)與患者的年齡、性別、腫瘤數(shù)目無(wú)關(guān)(P0.05),而與腫瘤直徑、腫瘤是否復(fù)發(fā)、病理分級(jí)和臨床分期有關(guān),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。膀胱癌組織中cadm1蛋白表達(dá)(0.2613±0.1405)較正常組織(0.6957±0.0924)顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。膀胱癌組織中發(fā)生cadm1基因啟動(dòng)子cpg島甲基化其蛋白表達(dá)量明顯低于膀胱癌組織中未發(fā)生cadm1基因啟動(dòng)子cpg島甲基化其蛋白表達(dá)量,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。2、成功構(gòu)建cadm1過(guò)表達(dá)慢病毒載體phblv-ires-cadm1-zsgreen-pgk-puro、干擾慢病毒載體phblv-u6-shrnacadm1-zsgreen-puro及對(duì)應(yīng)空載體,并分別感染人膀胱癌t24細(xì)胞系,rt-pcr和wb結(jié)果顯示ad-cadm1-t24細(xì)胞cadm1mrna和蛋白表達(dá)量較ad-gfp1-t24和t24明顯上升;ad-shrna1-t24細(xì)胞cadm1mrna和蛋白表達(dá)量較ad-shrna2/3-t24,ad-gfp2-t24和t24明顯下調(diào)。成功獲得穩(wěn)定過(guò)表達(dá)和下調(diào)cadm1的t24細(xì)胞株。3、wb結(jié)果顯示,ad-cadm1-t24和5-aza-cdr-t24與ad-gfp1-t24,ad-sh1-t24,ad-gfp2-t24及t24相比,凋亡相關(guān)蛋白caspase-3,bax表達(dá)量升高,bcl-2表達(dá)量降低,bcl-2/bax比值降低,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡;細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p27表達(dá)量顯著上調(diào),cyclind1,cdk2,cycline1表達(dá)量顯著下調(diào);emt相關(guān)蛋白e-cadherin,β-catenin表達(dá)量顯著上調(diào),vimentin表達(dá)量顯著下調(diào),上調(diào)cadm1表達(dá)可抑制膀胱癌t24細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。4、mtt檢測(cè)結(jié)果顯示,ad-gfp1-t24,ad-gfp2-t24及t24細(xì)胞的增殖能力未出現(xiàn)明顯差別,而ad-cadm1-t24和5-aza-cdr-t24細(xì)胞的增殖能力明顯降低,ad-sh1-t24細(xì)胞的增殖能力明顯提高,ad-cadm1-t24與ad-gfp1-t24和t24、5-aza-cdr-t24與t24、ad-sh1-t24與ad-gfp2-t24和t24相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。體外transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示,ad-cadm1-t24,ad-gfp1-t24,ad-sh1-t24,ad-gfp2-t24,5-aza-cdr-t24,t24細(xì)胞穿過(guò)聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)分別為(29.54±7.66),(65.57±10.02),(75.61±12.53),(61.32±15.43),(35.36±8.53)和(59.54±14.58);統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,ad-cadm1-t24與ad-gfp1-t24和t24、5-aza-cdr-t24與t24、ad-sh1-t24與ad-gfp2-t24和t24相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期結(jié)果顯示,ad-cadm1-t24,ad-gfp1-t24,ad-sh1-t24,ad-gfp2-t24,5-aza-cdr-t24,t24細(xì)胞g0-g1期細(xì)胞比例(%)分別為(62.11±1.73),(40.73±1.83),(37.14±3.14),(41.50±2.75),(54.10±7.32),(42.93±5.00);s期細(xì)胞比例分別為(17.39±3.12),(35.74±2.41),(43.94±3.17),(34.74±2.87),(23.98±7.39),(34.66±3.64);Ad-CADM1-T24與Ad-GFP1-T24和T24、5-Aza-CdR-T24與T24、Ad-sh1-T24與Ad-GFP2-T24和T24相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1、膀胱尿路上皮癌中,CADM1基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化可能是導(dǎo)致其蛋白表達(dá)下調(diào)的主要原因之一;CADM1基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。2、上調(diào)CADM1表達(dá)可明顯降低人膀胱癌T24細(xì)胞的增殖、侵襲能力,并可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。3、CADM1發(fā)揮抑癌作用的機(jī)制可能與抑制細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、調(diào)控和細(xì)胞周期、凋亡、增殖等相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。4、甲基化抑制劑5-Aza-Cd R可逆轉(zhuǎn)CADM1基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài),從而誘導(dǎo)其重新表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：膀胱癌 細(xì)胞粘附分子1 腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 細(xì)胞凋亡甲基化 5-氮雜-2-脫氧胞苷
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.14
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-13
• 縮略語(yǔ)/符號(hào)說(shuō)明13-15
• 前言15-17
• 研究現(xiàn)狀、成果15-16
• 研究目的、方法16-17
• 一、膀胱癌組織中CADM1啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)和蛋白表達(dá)及其臨床意義17-27
• 1.1 對(duì)象和方法17-22
• 1.1.1 組織標(biāo)本17
• 1.1.2 主要試劑17-18
• 1.1.3 主要儀器18
• 1.1.4 MSP檢測(cè)CADM1基因啟動(dòng)子CpG島甲基化狀態(tài)18-20
• 1.1.5 WB檢測(cè)CADM1基因蛋白表達(dá)情況20-22
• 1.1.6 統(tǒng)計(jì)分析22
• 1.2 結(jié)果22-24
• 1.2.1 CADM1基因甲基化狀態(tài)及其與臨床病理特征的關(guān)系22
• 1.2.2 CADM1蛋白表達(dá)情況及其甲基化與蛋白表達(dá)量的關(guān)系22-24
• 1.3 討論24-26
• 1.3.1 CADM1簡(jiǎn)介及功能概述24-25
• 1.3.2 CADM1基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)和蛋白表達(dá)25-26
• 1.4 小結(jié)26-27
• 二、構(gòu)建CADM1過(guò)表達(dá)和干擾T24細(xì)胞系27-52
• 2.1 對(duì)象和方法27-37
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象27
• 2.1.2 主要試劑27
• 2.1.3 主要儀器27-28
• 2.1.4 細(xì)胞復(fù)蘇28
• 2.1.5 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)28
• 2.1.6 細(xì)胞傳代28-29
• 2.1.7 細(xì)胞凍存29
• 2.1.8 CADM1過(guò)表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建并穩(wěn)轉(zhuǎn)T24細(xì)胞系29-34
• 2.1.9 CADM1干擾慢病毒載體構(gòu)建并穩(wěn)轉(zhuǎn)T24細(xì)胞系34-37
• 2.1.10 WB檢測(cè) 5-Aza-Cd R-T24細(xì)胞CADM1表達(dá)37
• 2.1.11 統(tǒng)計(jì)分析37
• 2.2 結(jié)果37-47
• 2.2.1 穩(wěn)定表達(dá)CADM1的T24構(gòu)建及鑒定37-42
• 2.2.2 穩(wěn)定干擾CADM1的T24構(gòu)建及鑒定42-46
• 2.2.3 WB檢測(cè) 5-Aza-Cd R-T24細(xì)胞CADM1表達(dá)表達(dá)情況46-47
• 2.3 討論47-50
• 2.3.1 關(guān)于慢病毒載體47-50
• 2.3.2 關(guān)于 5-Aza-Cd R50
• 2.4 小結(jié)50-52
• 三、CADM1過(guò)表達(dá)和干擾T24細(xì)胞功能變化52-65
• 3.1 對(duì)象和方法52-54
• 3.1.1 研究對(duì)象52
• 3.1.2 主要試劑52
• 3.1.3 主要儀器52
• 3.1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和傳代52
• 3.1.5 蛋白測(cè)定52
• 3.1.6 細(xì)胞增殖測(cè)定52-53
• 3.1.7 體外侵襲實(shí)驗(yàn)53
• 3.1.8 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期53-54
• 3.1.9 統(tǒng)計(jì)分析54
• 3.2 結(jié)果54-61
• 3.2.1 WB測(cè)定相關(guān)蛋白表達(dá)54
• 3.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖54
• 3.2.3 體外侵襲實(shí)驗(yàn)54-58
• 3.2.4 CADM1對(duì)細(xì)胞周期的影響58-61
• 3.3 討論61-64
• 3.4 小結(jié)64-65
• 結(jié)論65-66
• 參考文獻(xiàn)66-71
• 發(fā)表論文和參加科研情況說(shuō)明71-72
• 附錄72-75
• 綜述75-88
• 參考文獻(xiàn)83-88
• 致謝88

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 ;Lentivirus-mediated RNA Interference and Over-expression of CDK2AP1 CDNA Regulate CDK2AP1 Expression in Human Lung Cancer A549 Cells[J];Chemical Research in Chinese Universities;2011年03期

2 武立偉;劉曉強(qiáng);張霖;羅藝;王一;孫光;;肺癌腫瘤抑制因子1在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)[J];現(xiàn)代泌尿生殖腫瘤雜志;2009年05期

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本文編號(hào)：547848