目的腎間質(zhì)纖維化是所有慢性腎臟疾病發(fā)展至終末期的一個共同的病理損傷過程。前期研究我們發(fā)現(xiàn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體(human umbilical cord mesenchy stem cell derived exosomes,hucMSC-Ex)可緩解大鼠腎間質(zhì)纖維化,但具體作用機制尚不明確。外泌體來源的microRNAs(miRNAs)介導(dǎo)了細(xì)胞間的通訊行為,參與多種細(xì)胞生物學(xué)過程,并且在纖維化進程中發(fā)揮重要作用。因此,本研究擬從體內(nèi)外探討hucMSC-Ex攜載miRNAs緩解腎間質(zhì)纖維化的作用及具體機制。方法培養(yǎng)hucMSCs并收集培養(yǎng)上清,從中分離外泌體(hucMSC-Ex),對hucMSC-Ex進行形態(tài)大小及表面標(biāo)記鑒定。建立大鼠單側(cè)輸尿管結(jié)扎(unilateral ureteral obstruction,UUO)腎間質(zhì)纖維化模型,小動物活體成像檢測DIR標(biāo)記的hucMSC-Ex的體內(nèi)分布。采用尾靜脈注射hucMSC-Ex進行干預(yù),以PBS或人肺成纖維細(xì)胞來源外泌體(human lung fibroblasts derived exosomes,HFL1-Ex)為對照。HE...

【文章頁數(shù)】：73 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
英文縮略詞中英文注釋表
第一章 緒論
    1.1 腎纖維化
    1.2 腎間質(zhì)纖維化相關(guān)分子機制
        1.2.1 TGF-β/Smad信號通路
        1.2.2 Wnt/β-catenin信號通路
        1.2.3 Notch信號通路
    1.3 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在腎臟損傷中的應(yīng)用
        1.3.1 hucMSCs在組織再生中的應(yīng)用
        1.3.2 hucMSCs在腎臟損傷修復(fù)中的作用
    1.4 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體在組織再生中的應(yīng)用
        1.4.1 hucMSC-Ex在多種疾病中的應(yīng)用
        1.4.2 hucMSC-Ex在腎疾病中的應(yīng)用
    1.5 Micro RNAs(miRNAs)在腎臟纖維化治療中的作用
        1.5.1 促纖維化miRNA--miR-21
        1.5.2 抑纖維化miRNA--miR-29
        1.5.3 Exosomal miRNAs
第二章 研究目的、方案、意義
    2.1 研究目的
    2.2 研究方法
    2.3 實驗設(shè)計方案以及路線
        2.3.1 構(gòu)建體內(nèi)外模型,明確hucMSC-Ex的修復(fù)作用
        2.3.2 篩選hucMSC-Ex中的miRNAs,明確miRNA靶基因
        2.3.3 hucMSC-Ex緩解腎間質(zhì)纖維化的作用機制
    2.4 研究意義
第三章 hucMSC-Ex緩解腎間質(zhì)纖維化的實驗研究
    3.1 實驗材料與儀器
        3.1.1 實驗動物
        3.1.2 細(xì)胞株
        3.1.3 主要材料、試劑
        3.1.4 主要儀器、耗材
    3.2 實驗方法
        3.2.1 hucMSC-Ex收集、提取及鑒定
        3.2.2 UUO及hucMSC-Ex治療模型構(gòu)建
        3.2.3 hucMSC-Ex標(biāo)記進行動物活體成像
        3.2.4 天狼星紅染色
        3.2.5 免疫組織化學(xué)法
        3.2.6 hucMSC-Ex處理活化的HK-2 細(xì)胞
        3.2.7 細(xì)胞/組織蛋白和總RNAs提取
        3.2.8 逆轉(zhuǎn)錄
        3.2.9 實時熒光定量PCR
        3.2.10 Western blot
        3.2.11 免疫熒光染色
        3.2.12 統(tǒng)計學(xué)分析
    3.3 實驗結(jié)果
        3.3.1 hucMSCs的培養(yǎng)及hucMSC-Ex的鑒定分析
        3.3.2 hucMSC-Ex改善大鼠腎臟結(jié)構(gòu),減少膠原沉積
        3.3.3 hucMSC-Ex緩解腎間質(zhì)纖維化,抑制促纖維化因子表達
        3.3.4 hucMSC-Ex抑制TGF-β1 誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞纖維樣改變
    3.4 討論
第四章 hucMSC-Ex轉(zhuǎn)運miR-13474 靶向ADAM17
    4.1 實驗材料與儀器
        4.1.1 實驗動物
        4.1.2 細(xì)胞株
        4.1.3 主要材料、試劑
    4.2 主要儀器、耗材
    4.3 實驗方法
        4.3.1 外泌體總RNA提取
        4.3.2 miRNAs提取
        4.3.3 miRNAs逆轉(zhuǎn)錄
        4.3.4 熒光定量PCR
        4.3.5 外泌體miRNAs測序
        4.3.6 瓊脂糖凝膠電泳
        4.3.7 雙熒光素酶報告基因檢測
        4.3.8 細(xì)胞si RNA轉(zhuǎn)染
        4.3.9 Western blot
        4.3.10 組織/細(xì)胞m RNAs提取、逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR
        4.3.11 組織/細(xì)胞蛋白提取及Western blot
        4.3.12 免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色
    4.4 實驗結(jié)果
        4.4.1 hucMSC-Ex高表達miR-13474
        4.4.2 hucMSC-Ex處理組高表達miR-13474
        4.4.3 Mi R-13474 靶向ADAM17
        4.4.4 hucMSC-Ex下調(diào)ADAM17表達
        4.4.5 ADAM17與miR-13474 的相互作用
    4.5 討論
第五章 hucMSC-Ex-miR-13474 靶向ADAM17緩解腎間質(zhì)纖維化的機制研究
    5.1 實驗材料與儀器
        5.1.1 細(xì)胞株
        5.1.2 主要材料、試劑
        5.1.3 主要儀器、耗材
    5.2 實驗方法
        5.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗
        5.2.2 細(xì)胞m RNAs提取、逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR
        5.2.3 細(xì)胞miRNAs提取、逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR
        5.2.4 Western blot
        5.2.5 免疫熒光染色
        5.2.6 超聲法
        5.2.7 平板克隆實驗
        5.2.8 細(xì)胞凋亡檢測實驗
    5.3 實驗結(jié)果
        5.3.1 過表達miR-13474 下調(diào)ADAM17表達,抑制TGF-β 和 α-SMA表達
        5.3.2 敲減miR-13474 促進ADAM17及TGF-β 和 α-SMA表達
        5.3.3 hucMSC-Ex-miR-13474 抑制ADAM17表達,抑制纖維化
        5.3.4 MiR-13474 促進細(xì)胞增殖,不影響細(xì)胞凋亡
    5.4 討論
第六章 結(jié)論與展望
    6.1 結(jié)論
    6.2 展望
參考文獻
致謝
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及參加會議



本文編號：3927145