本文關鍵詞：FC-99通過抑制DCs分泌BAFF緩解狼瘡性腎炎的機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus, SLE)是一種典型的自身免疫病,并伴隨有不同的臨床表現(xiàn)。狼瘡性腎炎(LN)是引起SLE患者死亡的主要原因。越來越多的證據(jù)表明,LN患者體內有過度活化的循環(huán)B細胞和失去對自身抗原耐受性的B細胞,且自身抗體的沉積和多種免疫細胞的活化可以促進LN的發(fā)病進程。因此,B細胞被認為是治療LN的重要靶點之一。B細胞活化因子(BAFF)是腫瘤壞死家族成員之一,對B細胞的增殖、活化及抗體分泌有重要作用。值得注意的是,可溶性的BAFF在SLE患者血清以及狼瘡小鼠器官中都是高表達。許多類型的細胞包括單核細胞和樹突狀細胞(DCs)都可以產生BAFF,但是SLE患者BAFF被認為主要來源于髓樣DCs。DCs在LN的早期被激活,活化的DCs可以通過分泌型的BAFF增強B細胞的功能,并參與LN疾病發(fā)展。重要的是,TLR4通路已經(jīng)被證明在LN的發(fā)病進程中起關鍵作用。TLR4通路活化后,DCs可以產生并分泌BAFF。前期我們的實驗證明,小分子化合物FC-99具有保護實驗性膿毒癥損傷和誘導性腸炎的作用。我們前期還發(fā)現(xiàn),FC-99可直接與IRAK4相互作用,而IRAK4在TLR4激活DCs活化中起著重要作用。因此,我們推測FC-99可以通過靶向IRAK4抑制DCs活化從而緩解LN。然而,關于FC-99能否影響DCs的活化及其BAFF的表達以及是否對SLE小鼠的LN具有療效果迄今未見報道。因此,本研究分析了FC-99緩解MRL/lpr小鼠狼瘡性腎炎的效果；評價了FC-99對TLR4刺激后DCs分泌BAFF的影響；揭示了FC-99抑制DCs分泌BAFF的作用機制。(1)發(fā)現(xiàn)FC-99可緩解MRL/lpr狼瘡小鼠的狼瘡性腎炎：我們首先利用MRL/lpr狼瘡小鼠模型,探究了FC-99對狼瘡性腎炎疾病進程的影響。發(fā)現(xiàn)FC-99可降低第20周的SLE小鼠尿蛋白的水平以及抑制1腎臟淋巴細胞浸潤、IgG和C3c沉積以及炎性因子的產生；FC-99還可減少MRL/lpr小鼠血清中自身抗體IgG、IgM和IgG2a的水平。這些結果表明,FC-99具有緩解MRL/lpr小鼠LN的作用。(2)發(fā)現(xiàn)FC-99可抑制LPS誘導的DCs活化及其BAFF產生：已知自身抗體主要是由B細胞產生,我們推測FC-99可以抑制B細胞活化。因此,我們檢測了FC-99處理組小鼠與空白對照組小鼠脾臟中B細胞的比例、活化及成熟的變化情況。結果表明,FC-99處理組小鼠脾臟總B細胞的百分比、活化B細胞的百分比以及成熟B細胞的百分比都顯著降低；FC-99還可減少成熟B細胞表面活化標志CD40和CD86的表達。以上結果表明,FC-99是通過抑制DCs產生BAFF減少自身抗體的產生來緩解狼瘡性腎炎。眾所周知,活化的DCs通過TLR4/IRAK4/NF-KB通路產生。為探究FC-99能否影響B(tài)AFF的產生,我們體外檢測FC-99對LPS誘導的DCs活化的影響。結果表明,FC-99不僅可以顯著降低細胞活化表面標志CD40、CD86、MHCⅡ和CD80的表達還可以顯著降低BAFF的mRNA表達水平和蛋白表達水平。進一步,由于BAFF可以促進B細胞活化,我們推測FC-99預處理的DCs可以影響B(tài)細胞的增殖與活化。我們的結果顯示,FC-99預處理的DCs與B細胞共同培養(yǎng),可以顯著抑制B細胞增殖活化。而且,BAFF中和抗體可以明顯消除這種作用。更重要的是,FC-99既不能直接抑制B細胞活化也不能直接抑制B細胞增殖。以上結果表明,FC-99是通過減少BAFF產生,抑制B細胞活化。(3)發(fā)現(xiàn)FC-99通過抑制IRAK4磷酸化降低LPS誘導的DCs活化及其BAFF產生：我們前期發(fā)現(xiàn),FC-99可抑制巨噬細胞RAW264.7的IRAK4磷酸化以及下游信號轉導。為了檢測FC-99能否影響DCs的IRAK4磷酸化,DCs用100ng/mlLPS處理15分鐘,然后利用Western Blotting分析。接著我們檢測了下游NF-κB通路和MAPK通路的活化情況,結果發(fā)現(xiàn),LPS可通過抑制IκBα磷酸化影響LPS誘導的DCs細胞NF-κB通路的活化。進一步我們發(fā)現(xiàn),FC-99可以通過減少p-38、P-JUK和P-ERK的磷酸化水平抑制LPS誘導的DCs細胞MAPK通路的活化。綜上所述,FC-99可抑制DCs的IRAK4磷酸化及其BAFF的產生,進而導致B細胞活化的降低,從而緩解MRL/lpr狼瘡小鼠LN的發(fā)病進程。我們的研究結果提示,FC-99可能是一個治療LN的潛在小分子化合物。
【關鍵詞】：FC-99 狼瘡性腎炎 樹突狀細胞 B細胞活化因子 B細胞
【學位授予單位】：南京大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R593.242
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-12
• 縮略詞表12-14
• 第一章 前言14-17
• 第二章 FC-99緩解狼瘡性腎炎的發(fā)病進程17-25
• 1.1 引言17-18
• 1.2 實驗材料18-19
• 1.2.1 實驗對象18
• 1.2.2 主要試劑18
• 1.2.3 主要儀器設備18-19
• 1.3 實驗方法19-21
• 1.3.1 實驗動物分組19
• 1.3.2 FC-99治療小鼠狼瘡性腎炎19
• 1.3.3 小鼠尿蛋白濃度統(tǒng)計19
• 1.3.4 ELIAS檢測小鼠自身抗體沉積情況19-20
• 1.3.5 小鼠血清炎性因子的檢測20
• 1.3.6 實時定量PCR20-21
• 1.3.7 數(shù)據(jù)分析21
• 1.4 實驗結果與分析21-23
• 1.4.1 FC-99緩解MRL/lpr小鼠狼瘡性腎炎21-23
• 1.5 討論23-25
• 第三章 FC-99可抑制LPS誘導的DCS活化及其BAFF產生25-44
• 2.1 引言25
• 2.2 實驗材料25-27
• 2.2.1 實驗對象25-26
• 2.2.2 主要實驗試劑26
• 2.2.3 實驗儀器和設備26-27
• 2.3 實驗方法27-32
• 2.3.1 流式分析27
• 2.3.2 FC-99的配置27
• 2.3.3 骨髓細胞的制備和髓樣樹突狀細胞的培養(yǎng)27-28
• 2.3.4 CCK-8法檢測細胞活力28-29
• 2.3.5 流式細胞術檢測DCs活化的表面標志29
• 2.3.6 Q-PCR檢測髓樣樹突狀細胞炎癥因子的表達29-31
• 2.3.7 ELISA檢測DCs培養(yǎng)上清中BAFF的表達31-32
• 2.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析32
• 2.4 實驗結果32-41
• 2.4.1 FC-99減少MRL/lpr小鼠脾臟中B細胞的百分比,活化和成熟32-35
• 2.4.2 FC-99抑制MRL/lpr小鼠DCs活化35-37
• 2.4.3 FC-99的化學結構及其對DC活力的影響37-38
• 2.4.4 FC-99可抑制TLR4信號誘導的DCs活化38-39
• 2.4.5 FC-99可以抑制LPS-誘導的DCs分泌BAFF39-40
• 2.4.6 FC-99通過減少DCs分泌BAFF抑制B細胞活化40-41
• 2.5 討論41-44
• 第四章 FC-99通過抑制IRAK4磷酸化降低LPS誘導的DCS活化及BAFF產生44-51
• 3.1 引言44
• 3.2 實驗材料44-45
• 3.2.1 實驗對象44-45
• 3.2.2 主要試劑45
• 3.2.3 主要儀器設備45
• 3.3 實驗方法45-47
• 3.3.1 Western blot45-47
• 3.4 數(shù)據(jù)分析47
• 3.5 實驗結果47-49
• 3.5.1 FC-99可以抑制IRAK4磷酸化水平48
• 3.5.2 FC-99對DCs細胞NF-κB通路和MAPK通路的影響48-49
• 3.6 討論49-51
• 結論51-52
• 參考文獻52-58
• 附錄58-62
• 碩士期間科研成果62-63
• 致謝63-64

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