本文關鍵詞：腎小管上皮細胞損傷誘導草酸鈣結石形成與大鼠泌尿系數(shù)字構建，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《南方醫(yī)科大學》 2012年

腎小管上皮細胞損傷誘導草酸鈣結石形成與大鼠泌尿系數(shù)字構建

張燊  

【摘要】：1研究背景及目的 泌尿系結石(Urolithiasis)是泌尿系統(tǒng)的常見疾病,迄今為止,對尿石形成的預防尚無十分理想的方法,80%以上的患者病因不清。在外科治療方面結石病的治療主要有經(jīng)皮腎造瘺,輸尿管鏡取石等多種微創(chuàng)外科技術與體外碎石(ESWL)治療,泌尿系結石治療后復發(fā)率為30%-50%。如果能夠從結石形成的機制出發(fā),研制出對延緩結石形成的針對性藥物,有極其重要的臨床價值。結石的形成亦受到流體動力學等因素的影響,用計算機模擬有限元分析的方法來進行研究成為目前的熱點,這就涉及到計算機建模的問題。如能利用相對較少的解剖數(shù)據(jù),對泌尿系進行參數(shù)化構建,不僅可滿足泌尿外科實驗研究的需求,同時也能為泌尿外科動物實驗及虛擬手術提供一個良好的平臺。 根據(jù)研究目的我們的研究分為四個部分： ①對非洲綠猴腎小管上皮細胞采用體外培養(yǎng)的方法,采用H202對其進行損傷,觀察損傷前后細胞成活率,并按損傷時間順序測定細胞與氧化損傷有關的酶及大分子的表達,細胞微結構的變化以及對草酸鈣晶體成核和聚集的影響。 ②對人近曲腎小管上皮細胞采用體外培養(yǎng)的方法,采用H202對其進行損傷,觀察損傷前后細胞成活率,并按損傷濃度測定細胞與氧化損傷有關的酶及大分子的表達,細胞微結構的變化以及對草酸鈣晶體成核和聚集的影響。 ③對日產(chǎn)大豆多糖進行提純,并在體外尿液體系中進行相應檢測,在非洲綠猴腎小管上皮細胞損傷模型的基礎上,研究提純前后的大豆多糖對Vero細胞中草酸鈣晶體生長的調(diào)控作用。 ④使用Autodesk3ds Max8SP2軟件,對COM及COD晶形及結石進行模擬；根據(jù)大鼠實體解剖,綜合運用放樣、布爾運算、多邊形造模、倒角剖面和車削等手段,對腎、腎上腺、血管、膀胱、氣管、甲狀腺和血管等器官進行真實比例構建,合并到手術場景中,經(jīng)渲染后獲取各角度的三維圖像。 目前對實驗用腎細胞的分類一般是根據(jù)動物來源進行劃分的。最早培養(yǎng)的細胞來自于鼠,包括NRK-52E,髓質(zhì)集合管細胞(pIMCD),大鼠的近端小管細胞(pMPT)等；第二種細胞來源于狗,如Madin-Darby犬齒腎細胞(MDCK);第三種來源于猴,如非州綠猴腎上皮細胞(BSC-1);第四種來源為豬,比如LLC-PK1;第五個來源為人,比如人的腎上皮細胞(HK-2)。在這里我們選取非洲綠猴腎小管上皮細胞(Vero)及人近曲腎小管上皮細胞(HKC)兩種細胞株進行了研究。 大豆多糖(SPS)是從大豆分離蛋白、豆腐和腐竹等生產(chǎn)加工的副產(chǎn)物豆渣纖維中提取,經(jīng)過預處理、酶解(纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶等)、分離、脫色、滅菌、干燥等工藝精制而成,且具有來源廣,價格低廉和無副作用等優(yōu)點。分析表明,SPS主要成分是半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸,并含有鼠李糖、巖藻木糖及葡萄糖等多種成分。其結構是以鼠李半乳糖醛酸和高聚半乳糖酸為主鏈,半乳聚糖和阿拉伯糖為側鏈結合的近似于球狀結構體,具有良好的分散性、水溶性和乳化性等特點。在這里我們的研究采用過氧化氫(Sevag)法來降解日產(chǎn)大豆多糖。 3D Studio Max軟件是Kinetix(Autodesk公司的多媒體商業(yè)機構)推出的一個動畫產(chǎn)品。使用它可以在PC機上得到真正的工作站動畫軟件的性能和圖像質(zhì)量。其經(jīng)過不斷的換代已成為目前世界上應用最廣泛的三維建模,動畫,渲染的大眾化軟件。在這里我們使用的是軟件Autodesk3ds Max8SP2(美國,Autodesk公司,ID：666-12345678),操作平臺為windows XP系統(tǒng)。 2研究方法 2.1VERO細胞損傷模型建立 非洲綠猴腎小管上皮細胞株VERO購自中科院上海細胞庫(編號：GN017),用含有10%新生小牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液培養(yǎng),保持37℃及飽和濕度環(huán)境,每隔1天更換1次培養(yǎng)液。根據(jù)實驗設計加入含有不同濃度H202的無血清培養(yǎng)液,細胞消化采用胰蛋白酶消化法,當細胞達80%-90%融合后,用PBS液洗滌細胞2次,用0.02%EDTA與0.25%Trypsin消化細胞,3-5min后于倒置顯微鏡下觀察消化程度；當大部分細胞變圓,細胞分離散開,表明消化適度,加入含10%新生小牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液終止消化,充分吹打細胞使其形成單細胞懸液。用CCK-8法來檢測H202造成細胞損傷的程度,用酶標儀在450nm處測量吸光度(A),計算細胞存活率(%),并繪制存活率-時間曲線和存活率-濃度曲線,細胞存活率(%)=A(實驗組)/A(對照組)×100% 2.2人腎小管上皮細胞損傷模型建立 人腎小管上皮細胞由上海長征醫(yī)院梅長林教授饋贈。細胞培養(yǎng)的條件同前,細胞采用不同濃度H202進行損傷,細胞種植培養(yǎng)液中含雙氧水0.1,0.3,0.5,1.0以及2.0mmol/L H2O2的培養(yǎng)基中1h。對照組培養(yǎng)液不含H202。在指定的時間點,吸出培養(yǎng)液,細胞用PBS洗兩次,并加入新鮮的培養(yǎng)基。然后,每孔加入10μ1的CCK-8。孵育4h后,450nm酶標儀檢測。 2.3細胞MDA和SOD濃度 采用雙抗體夾心法測定細胞中MDA、SOD濃度,包被單抗的微孔中依次加入丙二醛(MDA)／超氧化物歧化酶(SOD),再與HRP標記的MDA/SOD抗體結合,形成抗體-抗原-酶標抗體復合物,經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化作用下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色深淺和樣品中的丙二醛(MDA)／超氧化物歧化酶(SOD)正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),通過標準曲線計算樣品中丙二醛(MDA)／超氧化物歧化酶(SOD)的濃度。 2.4細胞的OPN表達 細胞加入4%多聚甲醛固定10min,再用PBS洗三次,每次3min；加入羊血清封閉20min,滴加入骨橋蛋白一抗(1：100),4℃過夜。PBS洗三次,避光滴加FITC二抗(1：100),37℃孵育30min后,PBS洗三次,最后用DAPI給細胞染色并封片,激光共聚焦顯微鏡觀察熒光。細胞核為藍色,骨橋蛋白顯綠色。 2.5SEM, XRD分析 細胞結晶孵育后,取出蓋玻片,用PBS液洗滌細胞2次,加入2.5%戊二醛固定24h,1%OsO4將細胞后固定,再用PBS液洗滌3次,梯度乙醇(30%、50%、70%、90%、100%)脫水,再用乙酸異戊酯固定后CO2臨界點干燥,噴金包被。用SEM觀察細胞形態(tài)和晶體生長情況,同時對蓋玻片上的晶體進行XRD檢測(5°2060°),確定晶體組分。 2.6細胞Zeta電位檢測 細胞清洗后,用PBS洗去未粘附的晶體,加入0.25%胰酶-0.02%EDTA消化液,充分吹打細胞,使細胞和晶體脫落,以1,000rpm/s離心收集細胞和晶體,吸除上清液,加入1000μl pH=7.86的PBS緩沖液使細胞和晶體重新懸浮,于樣品池中吸取約8001μ1懸浮液,用納米粒度儀測其Zeta電位。 2.7共培養(yǎng)后測量CaOxa的濃度 細胞于6孔板中培養(yǎng)加入含有亞穩(wěn)定的CaOxa溶液間質(zhì)孵育6h。取出6孔板中的載玻片,然后用PBS洗滌以去除沒有結合的晶體。 載玻片放于25m1燒杯中。然后,倒入10mlHNO3和0.5ml HClO4,樣品在電爐中消化直到清晰的固化形成。樣品不斷地加熱直到HClO4沸騰,冒煙,直至干掉。加熱干燥后置于室溫冷卻。然后,燒杯中加入3.0m1水溶解殘留。溶液中Ca2＋濃度用ICP方法測量。CaOxa晶體的數(shù)量使用Ca2+濃度來測量,結果用微克／每平方厘米表示。 2.8大豆多糖的提取 采用Sevag法對SPS進行處理以除去SPS中可能存在的少量蛋白。向多糖溶液中加入0.2倍體積的Sevag試劑(V氯仿：V正丁e=5：1),將混合液劇烈振蕩15分鐘后離心(4000rpm,10min),此時溶液分為兩層,上層為多糖溶液,下層為Sevag試劑與變性蛋白生成的凝膠。取上層液,再加入0.2倍體積的Sevag試劑,重復上述操作,共5次,合并水相,從中提取多糖。 利用過氧化氫(H202)對SPS進行降解。稱取1.2g多糖,用60m1蒸餾水溶解于100ml燒杯中,70℃條件下水浴攪拌溶解。溶解完畢后,迅速加入15m1體積分數(shù)為30%的H202,降解1.5h后,待溶液冷卻,用濃度為2mol/L的NaOH溶液調(diào)pH值到7。然后將溶液轉入圓底燒瓶中,在70℃水浴條件下旋轉蒸發(fā),待溶液體積減少至原體積的1／3時停止蒸發(fā),加入60ml的無水乙醇沉淀多糖過夜,將沉淀過濾,干燥之后進行稱重。 2.9多糖理化性質(zhì)測定 采用苯酚-硫酸法測定了SPS中多糖的百分含量；采用粘度法測定降解前后SPS的平均相對分子質(zhì)量。 2.10泌尿系結石數(shù)字構建 COM與COD單晶模型COM按六方體建模,先按比例建成圓柱形,邊數(shù)設為6,雙底面各頂點采用多邊形編輯命令調(diào)整頂點位置。COD按四角雙錐建模,先半高構建四棱錐,再用鏡相命令于Z軸復制另一半,兩個四棱錐成組。選用透明玻璃材質(zhì)球,調(diào)整參數(shù)為顏色白色,透明度40,半透明80,折射率1.5,亮度200,賦予晶體材質(zhì)。 結石模型使用圓球體,保持表面光滑。先用FFD4×4×4圓柱體調(diào)整表面,再利用噪波分別于X、Y、z軸設置0-100的數(shù)值,材料球填加合適貼圖。尿路采用管狀體造模,FFD4×4×4圓柱體調(diào)整表面,移至與結石相適應的部位。分別渲染生成圖片。 2.11大鼠泌尿系數(shù)字構建 使用Autodesk3ds Max8SP2軟件運用放樣、布爾運算、多邊形造模、倒角剖面和車削等手段,對腎、腎上腺、血管、膀胱、氣管、甲狀腺和血管等器官進行真實比例構建,合并到腹部及頸部手術場景中,并安裝自由攝像頭經(jīng)渲染后獲取各角度的三維圖像。 2.12統(tǒng)計學分析 統(tǒng)計學分析使用SPSS13.0軟件。數(shù)據(jù)表達采用均數(shù)±標準差來表示(χ-±s)。細胞存活率檢測采用One-Way ANOVA或Two-Way ANOVA方法,MDA、SOD, OPN表達,結晶體大小,數(shù)目等采用One-Way ANOVA方法檢驗,先進行Levene檢驗方差齊性,若P0.05,選擇基于方差齊性的方差分析結果；若P0.05選擇基于方差不齊的方差分析結果(Welch法)。若方差分析顯著后,則進一步多重比較,方差齊者采用LSD法比較,方差不齊者采用Games-howell比較法。降解前、后SPS的含糖量檢測采用配對樣本t檢驗。P0.05認為是差異具有統(tǒng)計學意義。 3結果 1濃度為0.15mmol/LH2O2可以明顯的損傷Vero細胞并在0.5h-2h內(nèi)按時間相關地減小細胞存活率； 2細胞損傷后,MDA濃度和OPN表達上升,而SOD水平減低； 3損傷的Vero細胞容易導致草酸鈣晶體的成核及聚集,誘導更多的COM結晶形成； 4損傷Vero細胞表面的Zeta變化比正常細胞更為劇烈,幾乎呈線性上升。 5H202會明顯的損傷HKC細胞,且在0.1～2mmol/L濃度范圍內(nèi)隨著劑量的增加會使細胞存活率下降。 6在細胞損傷后,MDA濃度以及OPN表達會升高,而SOD水平下降,這就會引起損傷細胞誘導的草酸鈣晶體數(shù)目的增多。 7正常細胞的表面初始Zeta電位高于損傷細胞,損傷細胞在c(H2O2)=0～1.5mmol/L的范圍內(nèi),隨其濃度的升高其細胞表面的Zeta電位呈一直下降的趨勢,而加入晶體后,Zeta電位會先下降再上升的再趨于平緩。說明細胞表面Zeta電位的下降可以為CaOxa晶體粘附提供更多的位點。 8通過雙氧水對水溶性的大豆多糖進行降解,降解后大豆多糖去除了蛋白成分,含糖量顯著的減少,且分子量由98,000降低到28,379； 9降解前、后的大豆多糖均能有效的抑制COM晶體的形成,但降解后的小分子量大豆多糖體現(xiàn)出更強的分子活性,對草酸鈣晶體的調(diào)控作用進一步的增強。 10SPS可以提高損傷Vero細胞的線粒體的膜電位。 11Vero細胞經(jīng)SPS作用后,細胞的形貌能逐漸恢復到正常狀態(tài),且其能誘導更多COD晶體的生成。 12用降解后小分子量SPS對損傷Vero細胞修復后,其誘導了尺寸較小的草酸鈣聚集體。 13利用3D Studio Max軟件,構建出結石單晶及泌尿系結石三維模型。 14采取相對簡單的方法和較少的數(shù)據(jù)在個人PC機上成功構建出大鼠泌尿系參數(shù)化模型。 15在手術場景中進行合并,模擬出大鼠原位,髂位及頸部腎移植情況。 4討論 本研究采用化學及生物學分析的研究方法,建立了穩(wěn)定的腎小管上皮細胞損傷模型,摸索出了一套細胞體外化學測試方法。這可以為生物礦化與臨床診斷相結合提供了依據(jù),利用生物統(tǒng)計學的方法設計實驗及分析數(shù)據(jù),使得出的結論更為客觀、準確。同時利用相對較少的解剖數(shù)據(jù),使用3D Studio Max軟件模仿結石的晶體及全貌,并對大鼠的泌尿系統(tǒng)進行參數(shù)化構建,模擬出大鼠原位及異位腎移植場景,以滿足泌尿外科動物解剖實驗的需求,同時也為泌尿系流體分析及虛擬手術提供一個良好的平臺。

【關鍵詞】：
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R692.4
【目錄】：

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10 傅深,章青,孫宜,陳海泉;不同亞型Akt/PI3K在腫瘤細胞凋亡中的作用[J];腫瘤;2005年04期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張海燕;姜宗培;常潔;朱恒梅;余學清;;NADPH氧化酶在TGF-β_1誘導的腎小管上皮細胞轉分化及細胞外基質(zhì)積聚中的作用[A];中華醫(yī)學會腎臟病學分會2006年學術年會論文集[C];2006年

2 唐曉鵬;張玲;;重組大鼠肝再生增強因子對慶大霉素誘導急性腎衰大鼠腎小管上皮細胞凋亡的影響[A];中華醫(yī)學會腎臟病學分會2006年學術年會論文集[C];2006年

3 尤莉;陳靖;楊海春;顧勇;郝傳明;;分化未成熟小管上皮細胞標志物Nestin在腎小管上皮細胞轉分化中表達的研究[A];2007年浙滬兩地腎臟病學術年會資料匯編[C];2007年

4 孫洞簫;;氟伐他汀對大鼠腎缺血再灌注損傷P21和PCNA表達的影響[A];中華醫(yī)學會腎臟病學分會2006年學術年會論文集[C];2006年

5 文瓊;余學清;黃昭;聶靜;李曉艷;駱寧;董秀清;劉煒;黎明濤;;TGF-β_1誘導腎小管上皮細胞轉分化的蛋白組學研究[A];中華醫(yī)學會腎臟病學分會2006年學術年會論文集[C];2006年

6 熊曉玲;賈汝漢;楊定平;丁國華;;厄貝沙坦抑制造影劑誘導的腎小管上皮細胞凋亡[A];中華醫(yī)學會腎臟病學分會2006年學術年會論文集[C];2006年

7 賀大林;李翔;薛玉泉;陳興發(fā);;ESWL致腎臟損傷的機制和防治研究[A];第十七屆全國泌尿外科學術會議論文匯編[C];2010年

8 唐曉紅;;羅格列酮對高糖刺激下腎小管上皮細胞凋亡及整合素β_1(Integrin-beta1)表達的影響[A];中華醫(yī)學會腎臟病學分會2006年學術年會論文集[C];2006年

9 樊均明;甘華山;楊寧;王宏天;李文斌;王燕翔;;阿魏酸鈉對順鉑誘導的腎小管上皮細胞凋亡的影響[A];中華醫(yī)學會腎臟病學分會2006年學術年會論文集[C];2006年

10 周建華;張瑜;;MHBs~(t167)對腎小管上皮細胞膜結合型補體調(diào)節(jié)蛋白表達的影響及意義[A];中華醫(yī)學會第十四次全國兒科學術會議論文匯編[C];2006年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張?zhí)锟?[N];中國人口報;2002年

2 ;[N];中國醫(yī)藥報;2003年

3 劉霞;[N];科技日報;2011年

4 ;[N];中國中醫(yī)藥報;2005年

5 鄭健剛；杜元灝；石學敏;[N];中國醫(yī)藥報;2005年

6 ;[N];中國醫(yī)藥報;2003年

7 ;[N];中國中醫(yī)藥報;2005年

8 ;[N];中國中醫(yī)藥報;2005年

9 孫忻;[N];科技日報;2003年

10 阿勝;[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2002年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張燊;腎小管上皮細胞損傷誘導草酸鈣結石形成與大鼠泌尿系數(shù)字構建[D];南方醫(yī)科大學;2012年

2 李麗;PAX2基因沉默在梗阻性腎病腎小管上皮細胞轉分化中作用機制的研究[D];中國醫(yī)科大學;2010年

3 王光蘭;IL-1β誘導腎小管上皮細胞轉分化及其與細胞骨架的關系[D];吉林大學;2010年

4 何春梅;血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）對腎小管上皮—間充質(zhì)細胞轉化的作用及機制探討[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2007年

5 謝愷慶;C-反應蛋白在慢性腎臟病進展中的作用及機制的研究[D];南方醫(yī)科大學;2010年

6 何玉華;腎康注射液對白蛋白誘導活化的腎小管上皮細胞表型轉化的實驗研究[D];成都中醫(yī)藥大學;2005年

7 丁巍;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在腎小管上皮細胞凋亡中的作用及機制研究[D];復旦大學;2012年

8 湯珣;siRNA抑制CTGF表達對高糖誘導腎小管上皮細胞肥大和轉分化的影響及機制[D];南方醫(yī)科大學;2009年

9 聶靜;銜接蛋白p66Shc對糖尿病腎病腎小管上皮細胞氧化損傷及凋亡的影響與機制研究[D];中南大學;2009年

10 寧建平;腎小管上皮細胞轉分化在DN發(fā)病中的作用及大黃酸對其影響的研究[D];中南大學;2007年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 向芳;圍產(chǎn)期大鼠血脂組成與乳腺炎癥相關基因的表達變化研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學;2011年

2 吳芳庚;環(huán)境溫度變化致大鼠小腸黏膜免疫屏障損傷的研究[D];南昌大學;2011年

3 張婷;骨髓間充質(zhì)干細胞促進腎臟缺血再灌注損傷修復的實驗研究[D];蘇州大學;2006年

4 楊科峰;基于BCI的大鼠運動行為控制的研究[D];鄭州大學;2011年

5 王靜;CKLF1-C19多肽對肺纖維化大鼠的治療作用研究[D];山東大學;2012年

6 郭愛華;鹽酸法舒地爾對內(nèi)毒素致大鼠急性腎損傷的防治作用研究[D];泰山醫(yī)學院;2010年

7 鐘麗敏;中樞M受體參與毒血癥大鼠星形膠質(zhì)細胞激活及細胞因子分泌的研究[D];蘇州大學;2011年

8 彭晶;乳化異氟醚對成年大鼠學習記憶功能的影響[D];遵義醫(yī)學院;2011年

9 瞿凌晨;環(huán)維黃楊星D肝臟毒性機制的研究[D];南京中醫(yī)藥大學;2012年

10 劉金鳳;螺蟲乙酯對大鼠的生理影響及其體內(nèi)分布檢測方法的建立[D];東北農(nóng)業(yè)大學;2011年

  本文關鍵詞：腎小管上皮細胞損傷誘導草酸鈣結石形成與大鼠泌尿系數(shù)字構建，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：165954