本文關(guān)鍵詞：EDHF參與腦血管痙攣的機制研究

  更多相關(guān)文章： EDHF SAH GJ重構(gòu) siRNA 血管環(huán)張力

【摘要】：目的內(nèi)皮源性的舒張因子主要包括:NO,PGI2以及EDHF,隨著血管管徑的變小,EDHF調(diào)節(jié)血管舒張的作用就愈發(fā)重要。EDHF調(diào)節(jié)血管的舒張作用依賴于正常的GJ通道功能,完成一個完整的EDHF反應(yīng)依賴于各細胞間正常的縫隙連接介導(dǎo)的細胞間通訊(GJIC)功能,其中Cx40及其相關(guān)GJ通道對EDHF舒張血管的作用至關(guān)重要,沉默Cx40表達可使ACh激發(fā)的EDHF血管舒張作用減弱。前期研究表明:1、SAH后發(fā)生腦血管痙攣。2、SAH后Cx43較正常腦血管明顯上升,Cx40上升不明顯。3、Cx43 si RNA腺病毒可下調(diào)Cx43的表達改善腦血管痙攣以及縫隙連接阻斷劑甘珀酸(CBX)同樣可以改善腦血管痙攣。我們推測,SAH后EDHF調(diào)節(jié)腦血管舒張功能障礙而發(fā)生腦血管痙攣原因是腦血管Cx發(fā)生重構(gòu),Cx43與Cx40的比例失調(diào),導(dǎo)致GJ通道功能改變,EDHF調(diào)節(jié)腦血管舒張的作用下降,隨后發(fā)生腦血管痙攣。為此,本實驗旨在:1、比較正常大鼠和SAH大鼠的基底動脈EDHF反應(yīng)。2、利用Cx43 si RNA腺病毒下調(diào)Cx43的表達,CBX阻斷SAH模型中的異常GJ通道,檢測基底動脈中EDHF反應(yīng)的變化,通過以上研究進一步明確EDHF參與SAH后腦血管痙攣的機理,為改善SAH的臨床預(yù)后尋找新的有效方法。方法1、SAH模型的建立及鑒定:正常SD大鼠腹腔麻醉,尾靜脈取血約0.3ml左右備用,顯微鏡下枕大池緩慢注射,24小時后進行二次注血,從而完成二次注血的蛛網(wǎng)膜下腔出血模型的建立。模型鑒定:取正常組,SAH3、7天大鼠基底動脈行HE染色。2、正常及SAH模型基底動脈EDHF反應(yīng)以及Cx43的表達:1)取SD大鼠基底動脈環(huán)游離后先用含前列環(huán)素抑制劑吲哚美辛(Indo)和一氧化氮合酶抑制劑N-硝基-L-硝基精氨酸(L-NAME)并通95%O2+5%CO2混合氣體充分飽和的PSS液預(yù)處理,再用60mmol/L KCl KPSS刺激預(yù)收縮,最后加入不同濃度ACh(10-9-10-5mol/L),使基底動脈環(huán)產(chǎn)生EDHF反應(yīng),通過powerlab生理信息采集與處理系統(tǒng)記錄各濃度ACh的張力值并計算出舒張百分比。2)取正常及SAH模型組SD大鼠進行體內(nèi)多聚甲醛固定,再分離出基底動脈體外固定行石蠟包埋后,進行免疫組化檢測,觀察Cx43在基底動脈環(huán)中的表達情況。3、Cx43 si RNA腺病毒預(yù)處理SAH模型的EDHF反應(yīng)及Cx43表達:1)Cx43腺病毒沉默效率的檢測:Cx43 si RNA腺病毒、空病毒分別行枕大池注射,設(shè)立Cx43病毒處理組、空病毒組,于0(正常)、3、7、14天處死SD大鼠,通過基底動脈的Western blotting來檢測Cx43 si RNA腺病毒的沉默效率。2)造SAH模型前一周,枕大池注射Cx43 si RNA腺病毒、空病毒對SD大鼠進行干預(yù),預(yù)處理后再行SAH模型建立,最后檢測Cx43 si RNA腺病毒、空病毒預(yù)處理SAH模型的EDHF反應(yīng)以及免疫組化觀察Cx43 si RNA腺病毒預(yù)處理SAH模型的Cx43的表達。4、甘珀酸預(yù)處理SAH模型后EDHF反應(yīng)的變化:試驗前取SAH模型組基底動脈用甘珀酸預(yù)處理30min,預(yù)處理完成后再行EDHF反應(yīng)的測定。結(jié)果1、SAH模型基底動脈通過HE染色可見管腔變窄、內(nèi)皮層增厚、皺縮明顯,提示模型建立成功。2、Western blotting的結(jié)果顯示:1)Cx43 si RNA腺病毒處理0(正常)、3、7、14天的Cx43蛋白表達情況為:0.796±0.02、0.604±0.03、0.369±0.04、0.394±0.01。其中病毒處理后3天Cx43表達下調(diào)(P0.05),有統(tǒng)計學(xué)意義;病毒處理7、14天后Cx43顯著下降(P0.01)。2)空病毒處理0、3、7、14天的Cx43表達情況為:0.68±0.04、0.67±0.01、0.69±0.03、0.70±0.02,處理3、7、14天后Cx43表達無明顯差異性(P0.05)。3、Cx43免疫組化的結(jié)果示:SAH后Cx43的陽性棕黃著色在內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、外膜細胞均有不同程度上升;Cx43 si RNA腺病毒預(yù)處理SAH后,Cx43的陽性棕黃著色在平滑肌細胞、外膜細胞有一定的下降。4、游離血管環(huán)張力試驗示:正常SD大鼠的基底動脈環(huán)張力實驗中ACh激發(fā)EDHF反應(yīng)引起的舒張反應(yīng)最大的舒張百分比為41.084±5.459%;SAH組3、7天的最大舒張百分比為7.096±5.573%、5.142±2.579%與正常組比有顯著的差異(P0.05);空病毒預(yù)處理SAH3、7天組最大舒張百分比為7.722±4.516%、8.714±2.641%與SAH模型組比差異不明顯(P0.05);Cx43 si RNA腺病毒預(yù)處理SAH3、7天組最大舒張百分比為51.268±14.072%、50.284±5.572%與SAH模型組比有顯著差異(P0.05);甘珀酸預(yù)處理SAH3、7天組最大舒張百分數(shù)分別為41.924±6.246%、42.50±13.693%與SAH模型組比有顯著的差異(P0.05)。結(jié)論1、SAH后腦血管痙攣的發(fā)生發(fā)展與EDHF舒張作用減弱有關(guān)。2、SAH后EDHF舒張功能減弱與Cx43上升后Cx43與Cx40比例失調(diào),GJ重構(gòu),GJ通道功能障礙有關(guān)。3、甘珀酸抑制SAH后異常重構(gòu)的GJ通道,EDHF舒張血管功能得到恢復(fù),CVS得到緩解。4、通過Cx43 si RNA腺病毒下調(diào)Cx43的表達,逆轉(zhuǎn)SAH后GJ重構(gòu),改善GJ通道功能,EDHF舒張血管功能得到恢復(fù),CVS得到緩解。
【關(guān)鍵詞】：EDHF SAH GJ重構(gòu) siRNA 血管環(huán)張力
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R743.35
【目錄】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-12
• 中英縮略詞表12-13
• 第1章 前言13-15
• 第2章 材料與儀器15-20
• 2.1 實驗動物15
• 2.2 實驗試劑15-18
• 2.2.1 主要購置試劑15-16
• 2.2.2 主要試劑的配制16-18
• 2.3 實驗儀器18-20
• 第3章 實驗方法20-29
• 3.1 蛛網(wǎng)膜下腔出血模型的建立20
• 3.2 HE染色對蛛網(wǎng)膜下腔出血模型的鑒定20-22
• 3.2.1 石蠟切片的制作20-21
• 3.2.2 標本進行脫蠟并染色鏡檢21-22
• 3.3 腺病毒及甘珀酸預(yù)處理模型的建立22
• 3.4 腺病毒沉默效率的檢測22-25
• 3.4.1 樣品總蛋白制備22-23
• 3.4.2 樣品蛋白含量測定23
• 3.4.3 配膠23
• 3.4.4 灌膠和上樣23
• 3.4.5 垂直電泳23-24
• 3.4.6 轉(zhuǎn)膜24
• 3.4.7 樣品蛋白免疫反應(yīng)24
• 3.4.8 蛋白化學(xué)發(fā)光及曝光24-25
• 3.4.9 膜再生25
• 3.4.10 內(nèi)參蛋白 β-actin免疫反應(yīng)25
• 3.4.11 圖像分析25
• 3.5 體內(nèi)試驗的分組25-26
• 3.6 免疫組化檢測Cx43 的表達26
• 3.6.1 石蠟切片的制作26
• 3.6.2 切片標本脫蠟、抗體孵育、鏡檢26
• 3.7 游離血管環(huán)張力測定26-28
• 3.7.1 啟動powerlab26-27
• 3.7.2 游離大鼠離體基底動脈環(huán)的制備及安裝27
• 3.7.3 游離基底動脈環(huán)的EDHF反應(yīng)引起舒張的變化曲線。27-28
• 3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析28-29
• 第4章 實驗結(jié)果29-35
• 4.1 SAH模型的鑒定29
• 4.2 Cx43 siRNA腺病毒沉默效率的檢測29-30
• 4.3 Cx43 免疫組化結(jié)果30
• 4.4 游離血管環(huán)張力試驗結(jié)果30-35
• 第5章 討論35-41
• 5.1 內(nèi)皮依賴性超極化因子35-36
• 5.2 內(nèi)皮依賴性超極化因子與血管舒張36-37
• 5.2.1 內(nèi)皮依賴性超極化因子與K+通道36
• 5.2.2 內(nèi)皮依賴性超極化因子與縫隙連接36-37
• 5.3 蛛網(wǎng)膜下腔出血后縫隙連接蛋白重構(gòu)與EDHF反應(yīng)的變化37-38
• 5.4 縫隙連接蛋白重構(gòu)與EDHF反應(yīng)變化機制的初步探討38-39
• 5.5 存在的問題39-41
• 第6章 結(jié)論與展望41-42
• 6.1 結(jié)論41
• 6.2 展望41-42
• 致謝42-43
• 參考文獻43-46
• 附圖46-49
• 綜述49-54
• 參考文獻51-54

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 吳遠水;洪濤;;縫隙連接在心腦血管疾病中的研究進展[J];江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2009年03期

2 洪濤;馮九庚;蔣麗萍;段劍;汪陽;江志群;;RNA干擾抑制血管平滑肌細胞縫隙連接Cx43介導(dǎo)的細胞間通訊[J];中華實驗外科雜志;2006年06期

3 洪濤,汪陽,蔣麗萍,高子云,辜斌,遲海波;縫隙連接阻斷劑1-庚醇對腦血管痙攣的抑制作用[J];中華神經(jīng)外科雜志;2005年04期

4 洪濤,Hill CE;縫隙連結(jié)在蛛網(wǎng)膜、軟腦膜及血管漿膜層中的表達[J];中華實驗外科雜志;2003年05期

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本文編號：990478