本文關(guān)鍵詞：延遲應(yīng)用不同劑量rhEPO治療大鼠急性擠壓性胸脊髓損傷

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【摘要】：背景脊髓損傷是骨科較為常見的疾病,近年來隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展以及交通運(yùn)輸網(wǎng)絡(luò)的不斷擴(kuò)張,意外事故的發(fā)生率逐年增加,脊髓損傷的發(fā)病率也有逐年升高的趨勢。據(jù)報(bào)道,每年約有10000名患者經(jīng)歷創(chuàng)傷性脊氁損傷在美國,由于中國人口基礎(chǔ)數(shù)是美國的數(shù)倍,所以我國每年發(fā)生創(chuàng)傷性脊髓損傷的患者應(yīng)當(dāng)遠(yuǎn)超10000人。對(duì)于脊髓損傷的患者來說,由于目前缺乏明顯有效的治療方法,其愈后往往不能獲得令人滿意的結(jié)果且治療費(fèi)用高昂,不同程度的增加了社會(huì)和家庭的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。對(duì)于年輕人來說,一旦發(fā)生較嚴(yán)重的脊髓損傷,這就意味著一生無法獨(dú)立自主的生活,給其身心造成巨大的影響。脊髓損傷的治療開始于第二次世界大戰(zhàn)在英格蘭,隨后在美國建成了多個(gè)脊髓損傷治療中心。盡管經(jīng)過幾十年的發(fā)展及對(duì)脊髓損傷病因及治療方法的研究,但是,對(duì)于如何降低由脊髓損傷引起患者的致殘率以及如何提高脊髓損傷后的治愈率,目前仍然是一個(gè)世界性難題。目前常用的藥物治療了措施包括：神經(jīng)節(jié)苷脂、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、甲強(qiáng)龍等。單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂(GM-1 ganglioside)是正常細(xì)胞膜的重要組成部分,在哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量非常豐富,特別是在突觸中含量尤其高。先前的研究表明：細(xì)胞膜上的GM-1含量的變化,對(duì)調(diào)節(jié)神經(jīng)元及細(xì)胞內(nèi)外信息傳遞發(fā)揮著重要的作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明GM-1可以促進(jìn)脊髓損傷的動(dòng)物運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù),其可能的作用機(jī)制包括：GM-1可以通過增強(qiáng)微管相關(guān)蛋白-2(microtubule-associated protein 2, MAP-2)的表達(dá)來發(fā)揮保護(hù)脊髓損傷后的神經(jīng)元,促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的作用；通過增加bcl-2凋亡抑制基因的表達(dá),在一定程度上減少細(xì)胞凋亡；通過穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)Ca2+平衡,減輕組織細(xì)胞水腫；降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng),降低興奮性氨基酸EAA的毒性；促進(jìn)神經(jīng)再生等。先前一個(gè)關(guān)于GM-1神經(jīng)節(jié)苷脂治療脊髓損傷的的前瞻性、隨機(jī)性、安慰劑對(duì)照、雙盲的實(shí)驗(yàn)研究被Geisler等人實(shí)施,該研究共納入37位患者,最后只有34位患者完成了實(shí)驗(yàn)：其中23位患者是頸椎脊髓損傷,11位患者是胸椎脊髓損傷；此外,每位患者接受治療藥物治療的時(shí)間在損傷后72小時(shí)內(nèi),所有患者隨訪1年,通過Frankle評(píng)分量表和美國脊髓損傷相關(guān)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分量表(ASIS)對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組患者進(jìn)行評(píng)估,其研究發(fā)現(xiàn)單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂可以改善脊髓損傷患者的運(yùn)動(dòng)功能,但是,本實(shí)驗(yàn)樣本量較少,尚不能夠提供很強(qiáng)的臨床證據(jù)來證明GM-1神經(jīng)節(jié)苷脂對(duì)脊髓損傷的患者有明顯的治療作用,此外,GM-1價(jià)格較為昂貴,不是所有的家庭都能承擔(dān)起長期的治療費(fèi)用,在一定程度上也限制了其應(yīng)用。找到一種價(jià)格適中且治療效果明確的藥物尚需進(jìn)一步大量的研究。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)具有保護(hù)損傷脊髓的作用,促進(jìn)神經(jīng)再生及修復(fù),改善運(yùn)動(dòng)功能,而且,脊髓損傷后本身也會(huì)產(chǎn)生一定量的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子,但是分泌量極少。目前腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子并沒有很好的用于臨床,主要是因?yàn)槟X源性神經(jīng)營養(yǎng)因子在血液中極容易被分解,在尚未通過血腦屏障前,絕大部分腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子已被滅活,達(dá)不到治療效應(yīng)的藥物濃度。盡管Liang等人報(bào)道了：給予急性脊髓損傷的大鼠行損傷段脊髓下埋管并通過該軟管定期注射腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子治療并取得良好治療結(jié)果,但是目前尚缺乏大規(guī)模臨床試驗(yàn)結(jié)果,此外,即使損傷段脊髓下埋管給藥治療具有一定的作用,但是在臨床應(yīng)用上具有一定的難度,脊髓下埋管一方面需要極高的穿刺埋管技術(shù),主要是避免加重脊髓損傷,另一方面是脊髓下埋管容易導(dǎo)致感染,需要極好的護(hù)理,一旦感染不僅會(huì)加重病情,甚至導(dǎo)致患者死亡,因此目前腦源性生長因子很難應(yīng)用于臨床,除非能夠找到良好的運(yùn)送載體。甲強(qiáng)龍(MP)是目前臨床用于治療急性脊髓損傷的首選方法,且必須在脊髓損傷后8小時(shí)內(nèi)給藥,否則治療效果將大大降低。但大劑量MP的應(yīng)用會(huì)造成許多嚴(yán)重的并發(fā)癥,如胃腸道出血、腸穿孔、無菌性股骨頭壞死、增加感染的機(jī)會(huì)等,目前許多臨床治療中心已不在將其作為脊髓損傷的首選治療方法,甚至有些治療中心徹底放棄這種治療方法。目前的研究顯示：與大劑量MP治療相比,應(yīng)用重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)治療大鼠急性脊髓損傷能夠更好的改善其運(yùn)動(dòng)功能。促紅細(xì)胞生成素(EPO)是一種糖蛋白和細(xì)胞因子,具有調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成的作用,在成人主要由腎臟產(chǎn)生,而在胎兒主要由肝臟產(chǎn)生,且組織缺氧是誘導(dǎo)其產(chǎn)生的關(guān)鍵因素。rhEPO具有與EPO相似的生物學(xué)作用,目前在臨床上被廣泛用于治療許多疾病,如慢性腎功能不全、腎性貧血、癌癥、手術(shù)后治療等。許多不同類型的脊髓損傷的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵炎C實(shí)rhEPO具有保護(hù)急性胸脊髓損傷的作用,但在他們的實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物獲得rhEPO治療在損傷后1小時(shí)內(nèi)。先前的一個(gè)研究報(bào)道延遲應(yīng)用rhEPO治療(損傷后1小時(shí)給藥)大鼠急性胸脊髓損傷缺乏神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。為了進(jìn)一步觀察延遲應(yīng)用rhEPO治療急性胸脊髓損傷是否具有神經(jīng)保護(hù),本實(shí)驗(yàn)通過應(yīng)用大鼠急性擠壓性胸脊髓損傷模型,比較對(duì)照組和不同劑量的實(shí)驗(yàn)組在損傷后2小時(shí)給藥后的治療效果,通過評(píng)估運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分、組織病理評(píng)級(jí)、凋亡指數(shù)、炎癥指數(shù)、脊髓超微結(jié)構(gòu)評(píng)分及脫髓鞘面積。目的全面系統(tǒng)的評(píng)估延遲應(yīng)用不同劑量的促紅細(xì)胞生成素治療大鼠急性擠壓性胸脊髓損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。方法本實(shí)驗(yàn)將分為兩個(gè)階段進(jìn)行,在第一階段中,共有32只健康雄性SD大鼠,將其平均隨機(jī)分為4組：對(duì)照組(A組,N=8)：按脊髓擠壓的方法造模后,分別在術(shù)后2小時(shí)、1、3天給予腹腔注射生理鹽水lml,此外,術(shù)前及術(shù)后第一天給予腹腔注射青霉素鈉(100000U/kg),預(yù)防術(shù)后感染；3000U實(shí)驗(yàn)組(B組,N=8)：按脊髓擠壓的方法造模后,分別在術(shù)后2小時(shí)、1、3天給予腹腔注射促紅細(xì)胞生成素(3000U/kg),此外,術(shù)前及術(shù)后第一天給予腹腔注射青霉素鈉(100000U/kg),預(yù)防術(shù)后感染；4000U實(shí)驗(yàn)組(C組,N=8)：按脊髓擠壓的方法造模后,分別在術(shù)后2小時(shí)、1、3天給予腹腔注射促紅細(xì)胞生成素(4000U/kg),此外,術(shù)前及術(shù)后第一天給予腹腔注射青霉素鈉(100000U/kg),預(yù)防術(shù)后感染；5000U實(shí)驗(yàn)組(D組,N=8’)：按脊髓擠壓的方法造模后,分別在術(shù)后2小時(shí)、1、3天給予腹腔注射促紅細(xì)胞生成素(5000U/kg),此外,術(shù)前及術(shù)后第一天給予腹腔注射青霉素鈉(100000U/kg),預(yù)防術(shù)后感染。在第二階段實(shí)驗(yàn)中,按與第一階段同樣實(shí)驗(yàn)的方法,將24只健康雄性SD大鼠同樣隨機(jī)分為4組：對(duì)照組(Aa組,n=6)：按照第一階段相同的造模方法,造模成功后,給予脊髓損傷大鼠lml生理鹽水腹腔注射在術(shù)后2小時(shí)、1、3、8、15、22天,此外,術(shù)前及術(shù)后第一天給予腹腔注射青霉素鈉(100000U/kg),預(yù)防術(shù)后感染；3000U(Bb組,n=6)：脊髓損傷大鼠被給予促紅細(xì)胞生成素(3000U/kg)通過腹腔注射在術(shù)后2小時(shí)、1、3、8、15、22天,此外,術(shù)前及術(shù)后第一天給予腹腔注射青霉素鈉(100000U/kg),預(yù)防術(shù)后感染；4000U(Bb組,n=6)：脊髓損傷大鼠被給予促紅細(xì)胞生成素(4000U/kg)通過腹腔注射在術(shù)后2小時(shí)、1、3、8、15、22天,此外,術(shù)前及術(shù)后第一天給予腹腔注射青霉素鈉(100000U/埏),預(yù)防術(shù)后感染；5000U(Bb組,n=6)：脊髓損傷大鼠被給予促紅細(xì)胞生成素(5000U/kg)通過腹腔注射在術(shù)后2小時(shí)、1、3、8、15、22天,此外,術(shù)前及術(shù)后第一天給予腹腔注射青霉素鈉(100000U/kg),預(yù)防術(shù)后感染。主要的觀察及研究指標(biāo)：在第一階段的實(shí)驗(yàn)SD大鼠,造模后共觀察4天,在術(shù)后-1(術(shù)前)、0、1、2、3、4天行BBB評(píng)分,術(shù)后第4天行BBB評(píng)分后予以過量的戊巴比妥鈉腹腔注射處死,取損傷脊髓節(jié)段用于炎癥指數(shù)、凋亡指數(shù)、組織病理觀察及脊萌超微結(jié)構(gòu)的研究；在實(shí)驗(yàn)第二階段的SD大鼠,共被觀察4周,在術(shù)后-1、0、2、4、7、14、21、28天行BBB評(píng)分及固藍(lán)染色(LFB)。脊髓損傷造模方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物先在動(dòng)物飼養(yǎng)房(溫度20±3℃,濕度50±20%,每日光照12h)內(nèi)適應(yīng)環(huán)境1周,每籠2只大鼠,自由進(jìn)食、水。動(dòng)物于術(shù)前12小時(shí)禁食、水,為了預(yù)防術(shù)后感染,術(shù)前30min給予青霉素鈉(200000U/kg)肌肉注射。戊巴比妥鈉(70mg/kg)腹腔注射麻醉后,將大鼠俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)上,用剪刀減去手術(shù)區(qū)域的毛發(fā),然后用3%碘伏消毒手術(shù)區(qū),在無菌條件下行背部正中切開約2cm長的切口,以T13為標(biāo)志,暴露T8-T12的棘突、橫突及椎板,應(yīng)用外科顯微器械,仔細(xì)去除T10的終板及黃韌帶,顯露T10水平的脊髓,用閉合力為70g的動(dòng)脈瘤夾夾持脊髓1min,然后去除動(dòng)脈瘤夾,生理鹽水沖洗切口后逐層縫合切口,再次用3%碘伏消毒手術(shù)切口。在手術(shù)期間,用一個(gè)加熱墊來維持大鼠的體溫,直至大鼠術(shù)后完全蘇醒。術(shù)后每只大鼠立即腹腔注射10%葡萄糖注射液2m1,0.9%的氯化鈉注射液5m1,大鼠完全蘇醒后,按每籠2只送回飼養(yǎng)室,術(shù)后每天人工輔助排尿2-3次/日。療效評(píng)估指標(biāo)BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分、組織病理評(píng)級(jí)、凋亡指數(shù)、炎癥指數(shù)、脊髓超微結(jié)構(gòu)評(píng)分及脫髓鞘面積；統(tǒng)計(jì)學(xué)方法SPSS 19.0((SPSS Inc., Chicago, IL, USA))統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件被用于分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。除了組織病理學(xué)評(píng)級(jí)結(jié)果,其他數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,在不同的研究時(shí)間點(diǎn)的BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的兩因素的ANOVA and post hoc LSD檢驗(yàn),膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)、神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)、脊髓超微結(jié)構(gòu)評(píng)分用one-way ANOVA and post hoc LSD檢驗(yàn)。對(duì)于非參數(shù)數(shù)據(jù)包括炎癥指數(shù)、凋亡指數(shù)、組織病理評(píng)級(jí)、脫髓鞘面積百分比則用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)比較組間差異,如果方差分析顯示：組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,各組之間的比較則用多個(gè)獨(dú)立樣本之間比較的Nemenyi檢驗(yàn)。當(dāng)P0.05時(shí),則表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果在第一階段實(shí)驗(yàn)中,32只SD大鼠共被觀察4天,各實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分在術(shù)后第4天分別為：A組(0.375±0.518)；B組(2.625±0.744)；C組(3.125±0.641)；D組(4.500±0.756),且在整個(gè)4天的研究期間,最好的運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分被觀察到在D組,此外,各實(shí)驗(yàn)組運(yùn)動(dòng)功能的改善均好于A組(P0.01)在此期間。在第二階段實(shí)驗(yàn)中,24只脊髓損傷SD大鼠共被觀察4周,在術(shù)后第28天的BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分分別為：Aa組(7.833±1.472)；Bb組(12.333±0.816)；Cc組(12.833±0.753)；Dd組(14.500±0.548),最好的運(yùn)動(dòng)功能改善情況同樣在Dd組被觀察到,各實(shí)驗(yàn)組的運(yùn)動(dòng)功能改善情況均好于Aa組(P0.001),此外,在第一和第二階段的實(shí)驗(yàn)中,3000U組和4000U組在改善急性胸脊髓損傷的大鼠運(yùn)動(dòng)功能方面作用相似(P0.05),盡管4000U組平均BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分稍微高于3000U組。組織病理學(xué)方面,5000U組獲得最好的組織病理學(xué)改善,而3000U組和4000單位組在組織病理學(xué)改善方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),但各實(shí)驗(yàn)組的病理改善情況好于對(duì)照組(P0.05)。各實(shí)驗(yàn)組的炎癥指數(shù)及凋亡指數(shù)均小于對(duì)照組(P0.05),但各實(shí)驗(yàn)組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。實(shí)驗(yàn)組的脊髓損傷超微結(jié)構(gòu)評(píng)分均好于對(duì)照組(P0.001),但各實(shí)驗(yàn)組在改善脊髓損傷超微結(jié)構(gòu)方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。就脫髓鞘面積百分比而言,實(shí)驗(yàn)組的脊髓損傷超微結(jié)構(gòu)評(píng)分均好于對(duì)照組(P0.005),且最好的髓鞘保護(hù)作用在5000U組被觀察到。結(jié)論(1)、延遲應(yīng)用促紅細(xì)胞生成素治療急性大鼠胸脊髓損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用；(2)、延遲應(yīng)用促紅細(xì)胞生成素具有降低細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、改善運(yùn)動(dòng)功能、保護(hù)脊髓超微結(jié)構(gòu)及促進(jìn)髓鞘修復(fù)的作用；(3)、最好的組織病理學(xué)改善、BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分及髓鞘保護(hù)作用在5000U組被觀察到；(4)、3000U、4000U及5000U組對(duì)脊髓超微結(jié)構(gòu)的改善顯示了保護(hù)作用,且各實(shí)驗(yàn)組之間的超微結(jié)構(gòu)保護(hù)作用相似；(5)、3000U、4000U及5000U組在抑制細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)方面具有相似的治療效果。
【關(guān)鍵詞】：促紅細(xì)胞生成素 延遲治療 脊髓損傷 神經(jīng)保護(hù)作用 超微結(jié)構(gòu) 大鼠
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R651.2
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-20
• 第一章 前言20-24
• 第二章 實(shí)驗(yàn)部分24-70
• 第一節(jié) 材料與方法24-38
• 第二節(jié) 結(jié)果38-57
• 第三節(jié) 討論57-69
• 結(jié)論69-70
• 參考文獻(xiàn)70-78
• 全文總結(jié)78-80
• 中英文縮略詞對(duì)照表80-81
• 學(xué)習(xí)期間發(fā)表論文81-82
• 致謝82-83

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 徐建廣;孔維清;付一山;;甲基強(qiáng)的松龍與神經(jīng)節(jié)苷脂治療大鼠急性脊髓損傷[J];中國脊柱脊髓雜志;2006年S1期

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本文編號(hào)：670764