本文關(guān)鍵詞：閾值下810nm微脈沖激光對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變治療機制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景50多年來,視網(wǎng)膜激光光凝治療被應(yīng)用于臨床治療各種眼底血管疾病。眾多臨床試驗闡釋了激光光凝在視網(wǎng)膜血管病變中的臨床療效,連續(xù)波激光主要通過激光的熱損傷作用起到治療視網(wǎng)膜血管疾病的作用,但激光損傷組織會造成各種并發(fā)癥如激光瘢痕進行性擴大,視網(wǎng)膜纖維化及視網(wǎng)膜新生血管膜等,這均會導(dǎo)致中心暗點及視力下降。為了減少激光能量對視網(wǎng)膜組織造成的損傷,我們提倡侵入性更少的治療策略。激光技術(shù)的進步推動選擇性激光光凝的發(fā)展,1990年P(guān)ankratov首次報道微脈沖激光(micropulse laser, MPL)治療模式,與連續(xù)波激光不同,它是以一系列短脈沖進行傳導(dǎo)的,由于脈沖間有較長的間歇時間,激光熱量不容易堆積,因而視網(wǎng)膜不產(chǎn)生可見損傷。1997年Friberg等報道810nm微脈沖激光治療糖尿病黃斑水腫(Diabetic Retinopathy Edema, DME)的臨床應(yīng)用。以后幾項臨床試驗也已證實閾值下微脈沖激光治療DME可與ETDRS激光光凝一樣有效或更優(yōu)。糖尿病常常并發(fā)糖尿病性視網(wǎng)膜病變(Diabetic Retinopathy, DR),它是最重要的可預(yù)防性致盲眼病之一,1/10糖尿病患者受到DME或增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病變(Proliferative Diabetic Retinopathy, PDR)的威脅�？剐律苌梢蜃�(anti-vascular endothelial growth factor, anti-VEGF)藥物成為現(xiàn)今治療DME及PDR的主要方法。然而抗VEGF藥物治療價格昂貴,且需要長年累月重復(fù)治療以得到或保持理想療效。另外多次玻璃體腔內(nèi)注射會增加眼內(nèi)炎發(fā)生概率,而眼內(nèi)炎的發(fā)生往往是災(zāi)難性的。DME主要是由于血-視網(wǎng)膜屏障(blood retinal barrier, BRB)功能的破壞所致,而PDR則由于視網(wǎng)膜新生血管形成所致,兩者的發(fā)生均與新生血管生成相關(guān)。RPE層細(xì)胞可產(chǎn)生VEGF及色素上皮源性因子(pigment epithelium-derived factor, PEDF)等血管生成調(diào)節(jié)因子,VEGF能夠促進血管生成,而PEDF則相反,它可使血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖抑制,使毛細(xì)血管內(nèi)皮功能穩(wěn)定,從而達到抑制血管生長的作用。目前關(guān)于視網(wǎng)膜血管疾病的發(fā)病機制認(rèn)為RPE產(chǎn)生的潛在細(xì)胞因子及細(xì)胞外血管因子是視網(wǎng)膜疾病比如DME的主要調(diào)節(jié)介質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)810nm微脈沖半導(dǎo)體激光對視網(wǎng)膜色素上皮層(Retinal pigment epithelium, RPE)具有專一性,它可以通過作用于細(xì)胞內(nèi)光受體來調(diào)節(jié)病理狀態(tài)如糖尿病的細(xì)胞活性,而對神經(jīng)視網(wǎng)膜及脈絡(luò)膜幾乎不造成影響。多項臨床試驗報道了810nm微脈沖激光可有效治療DME及PDR,而我們前期的體外細(xì)胞實驗研究也發(fā)現(xiàn)閾值下810nm微脈沖半導(dǎo)體激光在亞致死模式下對RPE細(xì)胞分泌血管生長調(diào)節(jié)因子的水平進行調(diào)節(jié)�；谝陨戏肿铀窖芯拷Y(jié)果及臨床試驗結(jié)果,本研究試圖以閾值下810nm微脈沖激光刺激糖尿病棕色挪威(Brown Norway, BN)大鼠視網(wǎng)膜,觀察VEGF和PEDF表達水平的變化以及微脈沖激光刺激后大鼠眼底血管熒光造影(fluorescein angiography, FFA)的改變,從而進一步探討閾值下810nm微脈沖激光對糖尿病大鼠RPE層分泌細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用及治療糖尿病性視網(wǎng)膜病變的分子機制。研究目的本研究旨在探討：1.閾值下810nm微脈沖激光刺激BN大鼠視網(wǎng)膜時不引起損傷性光斑的激光參數(shù)；2.閾值下810nm微脈沖激光刺激BN大鼠視網(wǎng)膜RPE層對其分泌VEGF及PEDF的調(diào)節(jié)作用；3.閾值下810nm微脈沖激光刺激糖尿病大鼠視網(wǎng)膜后眼底血管熒光造影的改變。研究方法1、實驗分組36只10周齡健康清潔雄性棕色挪威(BN)大鼠,體質(zhì)量280-320g,由北京維通利華動物有限公司提供(許可證號：SCXK(京)2012-0001)。隨機抽取6只用于探索無損傷激光斑的閾值下810nm微脈沖激光的參數(shù)。其余30只采用隨機數(shù)字表法將大鼠隨機分為4組。正常對照組2只(A1組),腹腔注射0.1ml/L枸櫞酸納溶液正常飼養(yǎng)2月后不給予任何干預(yù)；正常大鼠微脈沖激光組10只(A2組),腹腔注射0.1ml/L枸櫞酸納溶液正常飼養(yǎng)2月后給予微脈沖激光照射雙眼；糖尿病對照組3只(A3組),通過腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)建立糖尿病模型予高糖飲食飼養(yǎng)2月后不給予干預(yù)；糖尿病大鼠微脈沖激光組15只(A4組),通過腹腔注射STZ建立糖尿病模型予高糖飲食飼養(yǎng)2月后予微脈沖激光照射雙眼。2、探索810nm微脈沖激光刺激BN大鼠視網(wǎng)膜時不產(chǎn)生激光斑的激光參數(shù)腹腔內(nèi)注射水合氯醛(10%,3.5ml/kg)麻醉6只大鼠,雙眼復(fù)方托吡酰胺散瞳。其中1鼠作連續(xù)波激光對照,以532nm激光、100μm光斑、0.2s曝光時間、200mW功率圍繞大鼠視盤等距離刺激雙眼視網(wǎng)膜9個點,盡量避開大血管,其余5只鼠分別以不同激光功率(400mW,600mW,800mW,1000mW,1200mW), 100μm光斑、0.2s包絡(luò)時間、100Hz、10%負(fù)載系數(shù)圍繞大鼠視盤等距離刺激雙眼視網(wǎng)膜9個點,盡量避開大血管。激光照射后即刻拍攝眼底彩色照片。3、糖尿病動物模型的建立B1、B2組大鼠禁食12h后,將STZ溶解于O.lmol/L枸櫞酸納溶液(PH 4.5),按60mg/kg一次性腹腔注射后每天以高糖飲食飼養(yǎng)。A1、A2組大鼠腹腔注射等量的枸櫞酸鈉溶液。注藥72h后測空腹血糖,大于16.7mmol/L者定為糖尿病模型大鼠。B1、B2組大鼠飼養(yǎng)2月后予麻醉行眼底血管熒光造影(FFA)檢查視網(wǎng)膜情況。4、實驗干預(yù)及檢測將A2組大鼠及B2組大鼠分別隨機分成5個激光功率治療小組,以810nm微脈沖激光行全視網(wǎng)膜光凝,激光參數(shù)為100μm光斑,0.2s包絡(luò)時間,10%負(fù)載系數(shù),功率分別為400mW、600 mW、800 mW、1000 mW、1200 mW.微脈沖激光照射后24h后,隨機于每組大鼠取1只過量麻醉處死后,取視網(wǎng)膜-RPE-鞏膜復(fù)合體制作RIPA裂解液視網(wǎng)膜勻漿組織,以RT-PCR檢測VEGF及PEDF mRNA水平,以蛋白免疫印跡法(western-blot)檢測其VEGF及PEDF因子蛋白表達水平。5、微脈沖激光刺激后行FFA檢查微脈沖激光照射后2周、1個月麻醉余下大鼠,腹腔注射10%熒光素鈉注射液0.3m1,即刻行FFA檢查。6、統(tǒng)計學(xué)方法統(tǒng)計分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件(美國IBM SPSS Statistic公司)。數(shù)據(jù)結(jié)果根據(jù)正態(tài)性檢驗以后以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)或中位數(shù)表示。兩組間均數(shù)比較進行兩獨立樣本t檢驗或非參數(shù)檢驗。多組間均數(shù)比較進行LSD單因素方差分析。P0.05有統(tǒng)計學(xué)差異。研究結(jié)果1、不同功率微脈沖激光刺激大鼠視網(wǎng)膜的可見激光光斑情況連續(xù)波532nm激光圍繞大鼠視盤等距離刺激9個點,可見9個白色光斑,而810nm微脈沖激光刺激時當(dāng)激光功率為600mW及以下時,雙眼均未見灰白色光斑,而功率在800mW及以上時,開始出現(xiàn)激光光斑,且隨激光功率的升高,可見光斑也越多。2、糖尿病動物模型造模情況糖尿病組大鼠造模后第1天觀察大鼠尿量明顯增多,72小時后空腹血糖大于16.7mmol/L者有14只(14/18),B1組2只,B2組12只,造模成功率達77.8%。造模成功大鼠高糖飼養(yǎng)2個月后行FFA檢查發(fā)現(xiàn)8只(8/14)有局限性或彌漫性視網(wǎng)膜熒光素滲漏,但均未見臨床糖尿病性視網(wǎng)膜病變患者所出現(xiàn)的視網(wǎng)膜微動脈瘤、硬性滲出或黃斑水腫等情況。3、A1與B1組大鼠VEGF與PEDF蛋白水平差異A1組大鼠VEGF/β-actin為0.153±0.011,B1組大鼠VEGF/β-actin為0.429±0.051,兩者間有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(t=-12.865,P=0.000)。4、不同能量微脈沖激光照射下視網(wǎng)膜組織VEGF與PEDF蛋白及其mRNA水平正常大鼠或是糖尿病大鼠接受微脈沖激光刺激后VEGF均比對照組下降,且有統(tǒng)計學(xué)差異(F=38.373,p=0.000；F=13.69,p=0.000)；PEDF比對照組上升,且有統(tǒng)計學(xué)差異(F=27.771,p=0.000；F=5.966,p=0.001)。隨激光功率升高,VEGF表達量逐漸下降,PEDF表達量逐漸升高,當(dāng)功率為600-800mW時VEGF達到最低值,PEDF達到較高值,而當(dāng)激光功率繼續(xù)升高時,VEGF蛋白又有升高趨勢,而PEDF蛋白有下降趨勢。而VEGF與PEDF的mRNA水平與其蛋白水平呈大致一致的變化趨勢。5、B1與B2組大鼠間視網(wǎng)膜FFA結(jié)果差異B1、B2組大鼠干預(yù)前眼底FFA圖像均顯示后極部視網(wǎng)膜熒光滲漏,B1組大鼠不接受微脈沖激光刺激,于實驗第2周、1個月時視網(wǎng)膜熒光滲漏加重,呈彌漫性片狀滲漏,而B2組以600mW微脈沖激光刺激后第2周、1個月視網(wǎng)膜滲漏明顯減輕。結(jié)論1.10%負(fù)載系數(shù)的810nm微脈沖激光功率在600mW以內(nèi)時刺激BN大鼠視網(wǎng)膜不產(chǎn)生可見激光斑；2.閾值下810nm微脈沖激光刺激BN大鼠視網(wǎng)膜可使RPE層分泌VEGF減少,PEDF增多；3.閾值下810nm微脈沖激光刺激糖尿病大鼠視網(wǎng)膜后可使視網(wǎng)膜血管熒光滲漏減輕。
【關(guān)鍵詞】：微脈沖激光 糖尿病視網(wǎng)膜病變 視網(wǎng)膜色素上皮層 血管內(nèi)皮生長因子 色素上皮源性因子
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R587.2;R779.63
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 第一章 糖尿病大鼠與正常大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF及PEDF表達水平的比較15-28
• 1 前言15-17
• 2 實驗方法17-23
• 2.1 材料17-19
• 2.2 方法19-23
• 2.3 統(tǒng)計學(xué)處理23
• 3 實驗結(jié)果23-25
• 3.1 糖尿病模型造模情況23
• 3.2 正常大鼠與糖尿病大鼠VEGF與PEDF蛋白及其mRNA表達水平的差異23-25
• 4 討論25-26
• 5 結(jié)論26-28
• 5.1 糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF及其mRNA表運水平較正常大鼠上升，而PEDF及其mRNA表達水平較正常大鼠下降26-27
• 5.2 糖尿病模型大鼠造模后2個月行FFA檢查顯示局限性或彌漫性視網(wǎng)膜熒光n蚵，
  
  本文編號：431110
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