本文關(guān)鍵詞：腳橋核低頻電刺激影響6-OHDA帕金森大鼠的步態(tài)和丘腦腹外側(cè)核神經(jīng)遞質(zhì)水平，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景帕金森病(Parkinson's disease, PD)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)漸進(jìn)性神經(jīng)退行性疾病。該病以中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性為主要病理特征,常發(fā)病于中老年人。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示,在65歲以上老年人中,PD患病率大于1%,嚴(yán)重影響老年人的生活。臨床上PD主要表現(xiàn)為肢體靜止性震顫、僵直、運(yùn)動遲緩等運(yùn)動功能失調(diào),在疾病晚期還將出現(xiàn)步態(tài)困難和姿勢不穩(wěn)(postural instability and gait difficulty, PIGD)等軸性癥狀。該癥狀常常是導(dǎo)致患者致殘的主要原因。臨床上,治療帕金森病的主要方法有內(nèi)科藥物和外科手術(shù)治療。其中外科手術(shù)治療是在左旋多巴(levodapa, L-dopa)應(yīng)用之前發(fā)展起來,并且近年來再次興起的治療藥物難治性晚期PD患者運(yùn)動并發(fā)癥的手段。早期的手術(shù)方式主要是立體定向損毀腦深部神經(jīng)核團(tuán),包括蒼白球內(nèi)側(cè)部(globus pallidus internus, GPi)、丘腦(丘腦腹部中間核,ventral intermediate nucleus, Vim)和丘腦底核(subthalamic nucleus, STN)。立體定向腦深部電刺激術(shù)(deep brain stimulation, DBS)是相對損毀術(shù)的一種可調(diào)控和可逆的替代手段。該手術(shù)通過立體定向?qū)⒋碳る姌O植入特定的深部腦神經(jīng)核團(tuán),對核團(tuán)進(jìn)行刺激,調(diào)節(jié)引起癥狀的異常電活動,從而改善患者的癥狀。目前DBS已成為治療晚期PD患者最佳的外科方法,尤其對藥物難治性PD能取得顯著的臨床治療效果。盡管Vim-DBS可有效改善PD患者的震顫；GPi-DBS可有效改善PD患者對側(cè)肢體的震顫、強(qiáng)直、運(yùn)動遲緩；STN-DBS對肌強(qiáng)直、運(yùn)動遲緩、震顫均有效,但是以上治療方式對晚期PIGD療效欠佳。近來研究發(fā)現(xiàn),PIGD和腳橋核(pedunculopontine nucleus, PPN)功能失調(diào)有關(guān),目前PPN已被推薦為治療PIGD的潛在目標(biāo)核團(tuán)。然而對于低頻刺激PPN對PD大鼠步態(tài)方面的作用的報(bào)道甚少。CatWalk是一種嚙齒類動物自動步態(tài)檢測系統(tǒng),能夠客觀量化自發(fā)運(yùn)動期間動物的動、靜態(tài)步態(tài)參數(shù)。CatWalk方法已被用于評估了一系列動物模型的步態(tài)參數(shù),如疼痛和脊柱損傷模型。盡管研究者對PPN的興趣正在逐步增加,PPN-DBS治療PIGD的作用機(jī)制目前是不清楚的。實(shí)際上我們認(rèn)為探索PPN-DBS對PD狀態(tài)下運(yùn)動丘腦(大鼠主要包括ventrolateral and Ventroanterior thalamus nuclei,VA/VL)神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響,對近一步理解其治療軸性癥狀的機(jī)制可能是重要的。理由如下：1.PPN主要由膽堿能、谷氨酸和氨基丁酸能神經(jīng)元組成。PD病人和PD動物模型PPN存在膽堿能神經(jīng)元丟失。且膽堿能神經(jīng)元丟失被認(rèn)為與PD的PIGD相關(guān)。2.基底前腦主要由膽堿能神經(jīng)元組成,接受PPN的膽堿能投射,也存在變性。3.PPN和基底前腦均發(fā)送膽堿能纖維到運(yùn)動丘腦。4.運(yùn)動丘腦與大腦皮層多個(gè)區(qū)域存在纖維聯(lián)系,在整合基底節(jié)、小腦和皮層運(yùn)動相關(guān)信息方面發(fā)揮著重要作用。5.藍(lán)斑主要由去甲腎上腺素能神經(jīng)元組成,PD病人和動物模型存在藍(lán)斑變性�；谏厦嫠�,首先,評估PPN-DBS能否在PD動物模型上(如大鼠)改善步態(tài),有助于我們進(jìn)一步理解PPN-DBS的行為學(xué)作用。其次,與PIGD相關(guān)的幾個(gè)腦組織結(jié)構(gòu)均與運(yùn)動丘腦存在聯(lián)系,而運(yùn)動丘腦被認(rèn)為參與運(yùn)動相關(guān)信息的整合。它的異常狀態(tài)可能涉及到PIGD。因此研究PPN-DBS與運(yùn)動丘腦內(nèi)相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)水平的關(guān)系,可能對理解PPN-DBS改善PIGD的作用機(jī)制是至關(guān)重要的。目的通過CatWalk步態(tài)分析系統(tǒng)評估偏側(cè)6-OHDA損毀PD大鼠的步態(tài),并分析低頻刺激PPN對PD大鼠步態(tài)的影響,從而進(jìn)一步理解PPN-DBS在PD嚙齒動物模型上的行為學(xué)作用；探索PPN-DBS對偏側(cè)PD大鼠運(yùn)動丘腦(本實(shí)驗(yàn)位于VL亞區(qū))神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響,以加深理解PPN-DBS改善PIGD的潛在機(jī)制。當(dāng)前實(shí)驗(yàn)主要探索VL內(nèi)谷氨酸(glutamic acid, Glu),7-氨基丁酸(y-aminobutyric acid, y-GABA),乙酰膽堿(acetylcholine, ACh)和去甲腎上腺素(noradrenalin, NA)水平。方法1.實(shí)驗(yàn)分組SPF級成年雄性Sprague Dawley (SD)大鼠38只(重280-320g),隨機(jī)分為三組。A組,假損毀組(n=10),右側(cè)前腦內(nèi)側(cè)縱束(medial forebrain bundle, MFB)立體定向注射4μl生理鹽水；B組,損毀組(n=14),右側(cè)MFB注射4μl6-OHDA; C組,損毀+電極組(n=14),右側(cè)MFB注射4μl(3μg/μl) 6-OHDA,并且在右側(cè)PPN植入微電極。所有大鼠在VL區(qū)域接受微透析探針導(dǎo)管植入。2.使用CatWalk采集大鼠步態(tài)參數(shù)基線值：在立體定向手術(shù)前,所有大鼠進(jìn)行Catwalk適應(yīng)性訓(xùn)練1周。訓(xùn)練方法：將大鼠置入Catwalk通道,訓(xùn)練其自發(fā)連續(xù)不停頓地通過通道,每只大鼠早晚各訓(xùn)練一次,每次來回跑過通道至少5次,達(dá)到訓(xùn)練合格的大鼠給予食物獎賞,整個(gè)訓(xùn)練在安靜暗室中完成。訓(xùn)練合格標(biāo)準(zhǔn)為：大鼠需連續(xù)不停頓地通過通道,次數(shù)至少5次。訓(xùn)練結(jié)束后,在接下來的兩天,采集所有大鼠Catwalk步態(tài)數(shù)據(jù)作為基線值。3.立體定向手術(shù)手術(shù)1,A組,即假手術(shù)組的大鼠麻醉后固定在立體定向儀上,齒桿低于耳桿3.4mm,根據(jù)Paxinos and Watson的《大鼠腦立體定向圖譜》確定右側(cè)前腦內(nèi)側(cè)縱束(MFB)坐標(biāo)：前囟后2.0mm,旁開2.0mm,硬膜下8.0mm。在預(yù)定坐標(biāo)位置緩慢注射4ul含0.02%抗壞血酸的生理鹽水。B組和C組大鼠注射12ug/4ul的6-OHDA溶液(用含有0.02%抗壞血酸的生理鹽水溶解)。手術(shù)2,兩周后,B組和C組大鼠再次麻醉,頭部固定于立體定向儀,齒桿低于耳桿3.4mm,確定VL坐標(biāo)：前囟后2.28mm,旁開2.4mm,硬膜下5.4mm。在坐標(biāo)點(diǎn)植入微透析導(dǎo)管。同時(shí)確定PPN坐標(biāo)：前囟后7.9mm,旁開2.1mm,硬膜下7.0mm。C組大鼠然后按坐標(biāo)緩慢植入微電極。大鼠術(shù)后進(jìn)行1周恢復(fù)。4.采集步態(tài)參數(shù)在采集前,按照上述方法再次用CatWalk訓(xùn)練大鼠5天,加強(qiáng)記憶。隨后兩天,采集所有大鼠步態(tài),4次厭,每只大鼠每次通過跑道不少于5次。C組的大鼠在跑前15分鐘進(jìn)行電刺激,隨后5分鐘放入跑道測試,同時(shí)進(jìn)行電刺激。5.電刺激程序測試每只大鼠的刺激閾值。方法：調(diào)到頻率25Hz,脈寬80us,然后從20μA電流開始,逐步調(diào)高電流,每次5μA,進(jìn)行刺激,觀察大鼠的反應(yīng),若出現(xiàn)大鼠身體扭轉(zhuǎn)至一側(cè)或者頭部抖動,此時(shí)的電流強(qiáng)度確定為該大鼠的閾值。正式刺激時(shí)采用低于閾值20gA的電流,25Hz頻率和80μs脈寬刺激。在裝電極的大鼠,分別測試通電刺激和未通電狀態(tài)的步態(tài)。6.微透析程序探針的激活：(1)將探針固定于支架上,用人工腦脊液灌注各部分以排空氣泡。在連接探針時(shí),探針出口端所接的管不應(yīng)太長(約5cm),否則壓力大使薄膜脹氣。(2)首次使用時(shí)將探針、連接管和適配器浸泡于70%酒精中5-10min,并以1ul/min速度灌注70%酒精至少1h,流速不可大于10μl/min。以人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid, ACSF)取代70%酒精以1μl/min速度至少灌注1h。樣品收集：每30min收集一次樣本,棄去前面2小時(shí)的樣本,然后收集兩個(gè)基線樣本,(C組刺激20min)之后再收集6個(gè)樣本。樣品收集完成后放入-80度冰箱。待檢。回收率測定：將探針浸泡到含標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0.5nm、1nm、5nm、10nm、20nm的人工腦脊液里,用不含標(biāo)品的人工腦脊液以2ul/min灌流,每個(gè)濃度收集四次,收集量為40ul。回收率r=C收集/C腦脊液*100%。7.液相和液質(zhì)方法：(1)液相測定谷氨酸和γ-氨基丁酸：Hypersil ODS色譜柱,4.0mm×125mm,粒徑5Lm；流動相(A)：10 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4 PH7.2磷酸緩沖液(phosphate buffer, PB),含0.5%四氫呋喃(THF)；流動相(B)：PB-甲醇-乙腈(體積比50：35：15)。線性梯度：在0-25 min內(nèi),流動相B以線性從0%上升到100%；流速：1.0mL/min;柱溫40℃；檢測波長：0 min時(shí),激發(fā)波長340 nm,發(fā)射波長450 nm,20.5 min后,將波長切換至激發(fā)波長260 nm,發(fā)射波長305 nm。8.液質(zhì)測定ACh和NA方法乙酰膽堿Ach質(zhì)譜條件：母離子：146.1；子離子：87.1 (CE 12),60.2 (CE 8); Fr:72;電噴霧離子源ESI；正離子MRM模式。去甲腎上腺素NA質(zhì)譜條件：母離子：170；子離子：152.1 (CE 4),107 (CE 17); Fr:40;電噴霧離子源ESI；正離子MRM模式。色譜條件：色譜柱：C-18柱2.1mm×50mm,1.8μm流動相：A：乙腈；B：5 mmol/L乙酸銨+0.1%甲酸梯度洗脫條件：0～2 min,100%B,2～2.4 min,100%～20%B,2.4～2.6 min, 20%～100% B,2.7～5.0 min,100%B流速:0.3 mL/min9.組織化學(xué)：全部實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,大鼠常規(guī)麻醉,給予電刺激30s(30μA),使得電極尖端在腦組織上留下針道痕跡。開胸心臟灌注生理鹽水,再灌注4%多聚甲醛溶液固定(含1%的氰鐵化鉀),取腦組織置于4%多聚甲醛浸泡固定過夜,再置于25%蔗糖溶液中脫水。冰凍切片后,取PPN和VL部行尼氏染色以確定電極和微透析探針位置。黑質(zhì)致密處的切片行TH免疫組化染色。10.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù),計(jì)量資料用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。多組均數(shù)間的比較采用one-way ANOVA檢驗(yàn)；同一組個(gè)體PPN-DBS刺激和非刺激狀況的均數(shù)比較采用配對樣本t檢驗(yàn),以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：1.步態(tài)測試結(jié)果：與假手術(shù)組相比,6.OHDA損毀組大鼠顯示出增加的步態(tài)基數(shù)(base of support,BOS,后肢)；減少的步幅(stride)、最大接觸面積和強(qiáng)度(左前肢)(P0.05)。與刺激前相比,低頻刺激PPN明顯改善BOS和最大接觸面積(P0.05),對其他參數(shù)沒有影響。2.神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)果：與假手術(shù)組相比,6.OHDA損毀大鼠Glu和γ-GABA水平顯著升高,ACh水平明顯降低(P0.05),NA無變化。與刺激前相比,低頻刺激PPN明顯改善Glu濃度(P0.05),輕微改善ACh濃度,對其他參數(shù)無影響。結(jié)論：本研究展示低頻刺激PPN能夠改善PD大鼠部分步態(tài)缺陷,支持低頻刺激PPN能夠改善PD步態(tài)缺陷的建議；本研究也顯示低頻刺激PPN再平衡PPN-VL通路上Glu和ACh濃度,該現(xiàn)象提供了PD中PIGD潛在機(jī)制的一個(gè)可能的視角。
【關(guān)鍵詞】：帕金森病 深部腦刺激 catwalk 步態(tài) 微透析 神經(jīng)遞質(zhì) 大鼠
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R742.5
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 第一章 前言18-22
• 第二章 材料與方法22-34
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料22-26
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法26-34
• 第三章 結(jié)果34-41
• 3.1 大鼠的剔除情況34
• 3.2 免疫組化染色結(jié)果(Fig 5)34-35
• 3.3 尼氏染色結(jié)果35
• 3.4 大鼠自動步態(tài)檢測結(jié)果(Fig 8)35-37
• 3.5 大鼠神經(jīng)遞質(zhì)檢測質(zhì)譜圖37-38
• 3.6 大鼠神經(jīng)遞質(zhì)檢測結(jié)果(Fig 11、12)38-41
• 第四章 討論41-46
• 4.1 低頻刺激PPN的行為學(xué)效應(yīng)41-43
• 4.2 低頻刺激PPN對神經(jīng)遞質(zhì)的效應(yīng)43-45
• 4.3 技術(shù)說明45-46
• 第五章 結(jié)論46-47
• 參考文獻(xiàn)47-53
• 綜述53-79
• 參考文獻(xiàn)66-79
• 中英文縮略詞對照表79-80
• 攻讀碩士期間的研究成果80-81
• 致謝81-82

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：394014