本文關(guān)鍵詞：蠐螬的活血化瘀作用及其機(jī)制初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景心血管疾病是目前醫(yī)學(xué)上的一種多發(fā)病,嚴(yán)重威脅到患者的身心健康。近年來(lái),由于生活水平的提高,同時(shí)也由于環(huán)境的惡化,血管疾病發(fā)病成上升趨勢(shì),并且成為目前中國(guó)人群的首要死因。血栓拴塞是心血管系統(tǒng)疾病的中常見(jiàn)的一類(lèi)疾病,近年來(lái)嚴(yán)重危害人類(lèi)健康,也是導(dǎo)致死亡率最高的原因之一,如心肌梗死、腦血栓、深靜脈血栓、腦拴塞、肺拴塞等。這些疾病都已經(jīng)成為危害人類(lèi)生命和健康的重大疾病。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),在40歲以上人群中,心肌梗死的發(fā)生率每年為39.7/10萬(wàn)—64.0/10萬(wàn),腦卒中發(fā)生率每年為109/10萬(wàn)。血凝和血栓形成是這一類(lèi)疾病發(fā)病機(jī)制中涉及的重要的病理過(guò)程。因此,抗凝、預(yù)防血栓形成和將已形成的血栓溶解,已經(jīng)成為當(dāng)前臨床上對(duì)血栓性疾病的重要的防治方法。目前抗血栓藥主要包括抗凝血藥、纖維蛋白溶解藥和抗血小板藥三大類(lèi)。目前在臨床上廣泛應(yīng)用的抗栓治療藥物多為尿激酶或者組織酶原激活劑,但是由于其價(jià)格昂貴,難以滿(mǎn)足治療和預(yù)防血栓病的需要。同時(shí)由于血栓拴塞性疾病的高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率,臨床上迫切需要療效高、毒副作用低的防治藥物,而現(xiàn)有的藥物均有不同程度的缺點(diǎn)。如尿激酶、阿替普酶、瑞替普酶等對(duì)于血栓栓塞性血管性疾病的溶栓治療,“有效時(shí)間窗”短成為一主要問(wèn)題,且此難題在國(guó)際也未得到解決。針對(duì)以上情況,不少醫(yī)學(xué)同道尤其是中醫(yī)、藥界在這方面更是作出了艱辛的努力,雖然“中藥溶栓”療效目前還未得到醫(yī)學(xué)界公認(rèn),但給人們提供了積極的啟示。例如通過(guò)調(diào)整中藥組方藥物的選擇、劑量的大小,配伍的原則和技巧,經(jīng)過(guò)多年的摸索、臨床驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)其“有效時(shí)間窗”比溶栓西藥延長(zhǎng)了,從實(shí)踐中看到了“中藥溶栓”的曙光。昆蟲(chóng)來(lái)源的藥物資源豐富,目前昆蟲(chóng)來(lái)源的活性蛋白質(zhì)、多肽的研究已經(jīng)成為研究的一個(gè)新熱點(diǎn)。蠐螬,學(xué)名為東北大黑鰓金龜幼蟲(chóng),主要功效為破瘀、散結(jié)、止痛、解毒,作為一味中藥在中醫(yī)上有多種應(yīng)用,可以治療破傷風(fēng)、目中翳障、小兒丹毒等。另外,也有關(guān)于蠐螬用于活血化瘀的記載�！堕L(zhǎng)沙藥解》中記載：蠐螬,能化瘀血,最消塊�！毒V目》：蠐螬,《本事方》治筋急,養(yǎng)血地黃丸中用之,取其治血瘀痹也。由此可見(jiàn),蠐螬為行血化瘀的良藥。但是由于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)蠐螬活性組分的研究極其貧乏,活血化淤的機(jī)制也不明確,極大的限制了蠐螬在活血化淤方面的使用。我們從蠐螬腸腔內(nèi)容物中獲取了其粗提取物,在下文中簡(jiǎn)稱(chēng)"CEHDL",嘗試從西醫(yī)藥理的抗凝溶栓角度來(lái)證實(shí)蠐螬的“活血化瘀”作用,并探索其抗凝溶栓機(jī)制及其活性組分的性質(zhì)。目的1.從西醫(yī)藥理的抗凝溶栓角度來(lái)闡述蠐螬的活血化瘀作用2.探索蠐螬提取物抗凝溶栓的機(jī)制3.初步鑒定蠐螬活血化瘀活性物質(zhì)的性質(zhì)方法1.大鼠血漿復(fù)鈣化時(shí)間檢測(cè)蠐螬提取物體外抗凝活性從SD大鼠腹主動(dòng)脈取血并獲得貧血小板血漿,分別與陰性對(duì)照組生理鹽水,蠐螬提取物四個(gè)劑量組(12.5μg/ml,25μg/ml,50μg/ml,100μg/ml)混勻于37℃水浴孵育5分鐘,然后再加入氯化鈣溶液(25mM)并搖勻,記錄從加入氯化鈣至液面凝固為止的時(shí)間,即為血漿復(fù)鈣化時(shí)間。2.小鼠尾靜脈出血時(shí)間檢測(cè)蠐螬提取物體內(nèi)抗凝活性將30只昆明小鼠隨機(jī)分為5組。分好組后,每組內(nèi)小鼠尾靜脈注射生理鹽水,三個(gè)濃度的蠐螬提取物(10μg/g,20μg/g,50μg/g),以及尿激酶。2小時(shí)過(guò)后,剪斷小鼠尾靜脈尾端5 mm,測(cè)定每組小鼠尾靜脈出血時(shí)間。3.體外血凝塊的溶解實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蠐螬提取物溶栓活性麻醉新西蘭家兔,心臟取血后待其自然凝固成血凝塊,然后將血凝塊分成大致相等的小份血凝塊,分為5組,每組血凝塊分別與陰性對(duì)照生理鹽水,蠐螬提取物三個(gè)濃度組(200μg/ml,400μg/ml,800μg/ml),尿激酶(100 u/m1)孵育。用倒置顯微鏡觀察每組溶液上清中因?yàn)檠ㄈ芙忉尫懦龅募t細(xì)胞數(shù)量,并拍照。12 h后,再分別根據(jù)血凝塊初始重量和末重之差來(lái)計(jì)算每組的溶栓率。4.卡拉膠誘導(dǎo)的血栓模型檢測(cè)蠐螬提取物抗小鼠尾靜脈血栓作用將32只昆明小鼠隨機(jī)分為4組,首先分別給予每組小鼠尾靜脈注射生理鹽水,兩個(gè)濃度的蠐螬提取物(20μg/g, 50μg/g),以及尿激酶。2h后,注射0.1%的角叉菜膠誘導(dǎo)尾靜脈血栓形成。24小時(shí)過(guò)后,統(tǒng)計(jì)每組小鼠尾靜脈血栓發(fā)生率,同時(shí)用卡尺測(cè)量每組內(nèi)發(fā)生血栓的小鼠尾靜脈血栓長(zhǎng)度,以觀察蠐螬提取物對(duì)小鼠尾靜脈血栓的影響。5.測(cè)定蠐螬提取物對(duì)纖維蛋白原的降解作用通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳,觀測(cè)不同濃度的蠐螬提取物對(duì)纖維蛋白原的降解作用,以及降解纖維蛋白原的三個(gè)亞基的順序6.測(cè)定蠐螬提取物對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的抑制作用大鼠心臟采血后用離心的方法獲得貧血小板血漿和富血小板血漿,用血小板聚集儀測(cè)定富血小板血漿中加入不同濃度的蠐螬提取物時(shí)的聚集曲線,并計(jì)算其對(duì)5 min內(nèi)對(duì)最大聚集率的抑制率。7.測(cè)定蠐螬提取物對(duì)纖維蛋白的降解作用及其降解方式用瓊脂糖做載體,用凝血酶激活纖維蛋白原變成纖維蛋白,制作成瓊脂糖纖維蛋白平板,再于85℃烘箱中烘烤30 min,制成滅活平板。在做好的纖維蛋白平板上打孔加入樣品,根據(jù)加樣孔周?chē)袩o(wú)溶圈形成及比較溶圈大小來(lái)判斷蠐螬提取物對(duì)纖維蛋白的降解作用及降解方式。8.蠐螬提取物的初步分離純化及纖溶活性物質(zhì)性質(zhì)鑒定蠐螬提取物的S-100HR分離純化后,通過(guò)與纖維蛋白原反應(yīng)后進(jìn)行凝膠電泳以檢測(cè)纖溶活性峰；通過(guò)觀察蠐螬提取物與分離材料DEAE sephadex-A50, CM Sephadex-C50的結(jié)合判定其中纖溶活性物質(zhì)為陰離子還是陽(yáng)離型；用Molish反應(yīng)鑒定蠐螬提取物中是否含糖類(lèi)。9.測(cè)定蠐螬提取物纖溶活性的影響因素通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳,觀測(cè)溫度、pH、金屬離子以及蛋白酶抑制劑對(duì)其纖溶活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.當(dāng)蠐螬提取物在血漿中的濃度達(dá)到25μg/mL以上時(shí),可以明顯延長(zhǎng)血漿復(fù)鈣化時(shí)間,而且延長(zhǎng)效果隨著蠐螬提取物濃度的增加而增加,說(shuō)明其具有良好的體外抗凝活性。2.小鼠尾靜脈出血時(shí)間實(shí)驗(yàn)表明,給予小鼠注射蠐螬提取物后,與陰性對(duì)照比較,可以明顯延長(zhǎng)小鼠尾靜脈出血時(shí)間,說(shuō)明其具有良好的體內(nèi)抗凝活性。3.在蠐螬提取物對(duì)血液形成的體外血凝塊的溶解實(shí)驗(yàn)中,隨著蠐螬提取物濃度的升高,因?yàn)槿芙庋龎K而釋放出來(lái)的血紅細(xì)胞數(shù)量明顯成增多趨勢(shì),而且在12h后,測(cè)定的實(shí)驗(yàn)組的血凝塊溶解率也明顯高于陰性對(duì)照組,這表明蠐螬提取物可以溶解體外血凝塊,也說(shuō)明其具有良好的體外溶栓活性。4.蠐螬提取物可以明顯的降低角叉菜膠誘導(dǎo)小鼠尾靜脈血栓發(fā)生率,同時(shí)可減短小鼠尾部血栓長(zhǎng)度,說(shuō)明其具有良好的體內(nèi)抗血栓活性。5.凝膠電泳實(shí)驗(yàn)表明,蠐螬提取物可以降解纖維蛋白原,而且對(duì)與纖維蛋白原三個(gè)亞基均有降解作用,同時(shí)對(duì)于三個(gè)亞基的降解順序依次為α→β→γ,推測(cè)蠐螬提取物通過(guò)降解纖維蛋白原發(fā)揮抗凝作用。6.蠐螬提取物可以輕度抑制ADP誘導(dǎo)的大鼠血漿聚集7.在滅活纖維蛋白平板試驗(yàn)中結(jié)果顯示,蠐螬提取物周?chē)纬扇苋?表明蠐螬提取物自身可以降解纖維蛋白,并且降解作用也是隨著濃度的增加而增加,但蠐螬提取物不能激活纖溶酶原,因此蠐螬提取物是通過(guò)自身降解纖維蛋白而發(fā)揮溶栓作用。8.蠐螬提取物纖溶性物質(zhì)經(jīng)S-100HR分離純化后在Ⅱ峰,纖溶性物質(zhì)為陰離子型,且不含糖類(lèi)。9.蠐螬提取物纖溶活性物質(zhì)在75℃以上失活,說(shuō)明為蛋白酶類(lèi),并且其纖溶活性可以被絲氨酸蛋白酶抑制劑部分抑制,EDTA對(duì)其纖溶活性無(wú)影響,說(shuō)明其纖溶活性成分含有絲氨酸蛋白酶但不含金屬蛋白酶：并且其在(pH3.0～pH10.0)范圍內(nèi)均能保持活性,而且各種金屬離子(Mg2+,Ca2+,Zn2+,Fe2+ Fe2+, Cu2+)對(duì)其纖溶活性幾乎無(wú)影響。結(jié)論1.蠐螬提取物可以延長(zhǎng)血漿復(fù)鈣化時(shí)間和小鼠尾靜脈出血時(shí)間,同時(shí)可以溶解體外血凝塊,這說(shuō)明其具有良好的抗凝和溶栓活性,從而達(dá)到活血化瘀功效。2.蠐螬提取物主要通過(guò)降解纖維蛋白原和直接降解纖維蛋白而發(fā)揮抗凝溶栓的作用。其對(duì)纖維蛋白原的三條鏈均有降解作用,并且降解順序?yàn)棣痢隆�；但不能激活纖溶酶原而是通過(guò)直接降解纖維蛋白而發(fā)揮溶栓作用。3.蠐螬的纖溶活性物質(zhì)含有絲氨酸蛋白酶但不含金屬蛋白酶,常見(jiàn)金屬離子和pH (pH3.0～pH10.0)對(duì)其纖溶活性影響較小。
【關(guān)鍵詞】：蠐螬 抗凝溶栓 纖維蛋白原
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5
【目錄】：

• 摘要4-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-28
• 第一章 蠐螬提取物體內(nèi)外抗凝溶栓效果評(píng)價(jià)28-42
• 一、實(shí)驗(yàn)材料及儀器28-29
• 二、實(shí)驗(yàn)方法29-32
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果32-42
• 第二章 蠐螬提取物抗凝溶栓的機(jī)制研究42-52
• 一、實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備42-43
• 二、實(shí)驗(yàn)方法43-45
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果45-52
• 第三章 蠐螬提取物纖溶性成分性質(zhì)鑒定52-66
• 一、實(shí)驗(yàn)材料及儀器52-53
• 二、實(shí)驗(yàn)方法53-56
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果56-66
• 第四章 討論66-71
• 結(jié)論71-72
• 參考文獻(xiàn)72-77
• 論文發(fā)表情況77-78
• 縮寫(xiě)詞中英文對(duì)照表78-79
• 致謝79-80

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

1 闞飛;孫捷;田路e

本文編號(hào)：394088