本文關鍵詞：蠐螬的活血化瘀作用及其機制初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景心血管疾病是目前醫(yī)學上的一種多發(fā)病,嚴重威脅到患者的身心健康。近年來,由于生活水平的提高,同時也由于環(huán)境的惡化,血管疾病發(fā)病成上升趨勢,并且成為目前中國人群的首要死因。血栓拴塞是心血管系統(tǒng)疾病的中常見的一類疾病,近年來嚴重危害人類健康,也是導致死亡率最高的原因之一,如心肌梗死、腦血栓、深靜脈血栓、腦拴塞、肺拴塞等。這些疾病都已經(jīng)成為危害人類生命和健康的重大疾病。據(jù)不完全統(tǒng)計,在40歲以上人群中,心肌梗死的發(fā)生率每年為39.7/10萬—64.0/10萬,腦卒中發(fā)生率每年為109/10萬。血凝和血栓形成是這一類疾病發(fā)病機制中涉及的重要的病理過程。因此,抗凝、預防血栓形成和將已形成的血栓溶解,已經(jīng)成為當前臨床上對血栓性疾病的重要的防治方法。目前抗血栓藥主要包括抗凝血藥、纖維蛋白溶解藥和抗血小板藥三大類。目前在臨床上廣泛應用的抗栓治療藥物多為尿激酶或者組織酶原激活劑,但是由于其價格昂貴,難以滿足治療和預防血栓病的需要。同時由于血栓拴塞性疾病的高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率,臨床上迫切需要療效高、毒副作用低的防治藥物,而現(xiàn)有的藥物均有不同程度的缺點。如尿激酶、阿替普酶、瑞替普酶等對于血栓栓塞性血管性疾病的溶栓治療,“有效時間窗”短成為一主要問題,且此難題在國際也未得到解決。針對以上情況,不少醫(yī)學同道尤其是中醫(yī)、藥界在這方面更是作出了艱辛的努力,雖然“中藥溶栓”療效目前還未得到醫(yī)學界公認,但給人們提供了積極的啟示。例如通過調(diào)整中藥組方藥物的選擇、劑量的大小,配伍的原則和技巧,經(jīng)過多年的摸索、臨床驗證,發(fā)現(xiàn)其“有效時間窗”比溶栓西藥延長了,從實踐中看到了“中藥溶栓”的曙光。昆蟲來源的藥物資源豐富,目前昆蟲來源的活性蛋白質(zhì)、多肽的研究已經(jīng)成為研究的一個新熱點。蠐螬,學名為東北大黑鰓金龜幼蟲,主要功效為破瘀、散結(jié)、止痛、解毒,作為一味中藥在中醫(yī)上有多種應用,可以治療破傷風、目中翳障、小兒丹毒等。另外,也有關于蠐螬用于活血化瘀的記載�！堕L沙藥解》中記載：蠐螬,能化瘀血,最消塊�！毒V目》：蠐螬,《本事方》治筋急,養(yǎng)血地黃丸中用之,取其治血瘀痹也。由此可見,蠐螬為行血化瘀的良藥。但是由于現(xiàn)代醫(yī)學對蠐螬活性組分的研究極其貧乏,活血化淤的機制也不明確,極大的限制了蠐螬在活血化淤方面的使用。我們從蠐螬腸腔內(nèi)容物中獲取了其粗提取物,在下文中簡稱"CEHDL",嘗試從西醫(yī)藥理的抗凝溶栓角度來證實蠐螬的“活血化瘀”作用,并探索其抗凝溶栓機制及其活性組分的性質(zhì)。目的1.從西醫(yī)藥理的抗凝溶栓角度來闡述蠐螬的活血化瘀作用2.探索蠐螬提取物抗凝溶栓的機制3.初步鑒定蠐螬活血化瘀活性物質(zhì)的性質(zhì)方法1.大鼠血漿復鈣化時間檢測蠐螬提取物體外抗凝活性從SD大鼠腹主動脈取血并獲得貧血小板血漿,分別與陰性對照組生理鹽水,蠐螬提取物四個劑量組(12.5μg/ml,25μg/ml,50μg/ml,100μg/ml)混勻于37℃水浴孵育5分鐘,然后再加入氯化鈣溶液(25mM)并搖勻,記錄從加入氯化鈣至液面凝固為止的時間,即為血漿復鈣化時間。2.小鼠尾靜脈出血時間檢測蠐螬提取物體內(nèi)抗凝活性將30只昆明小鼠隨機分為5組。分好組后,每組內(nèi)小鼠尾靜脈注射生理鹽水,三個濃度的蠐螬提取物(10μg/g,20μg/g,50μg/g),以及尿激酶。2小時過后,剪斷小鼠尾靜脈尾端5 mm,測定每組小鼠尾靜脈出血時間。3.體外血凝塊的溶解實驗檢測蠐螬提取物溶栓活性麻醉新西蘭家兔,心臟取血后待其自然凝固成血凝塊,然后將血凝塊分成大致相等的小份血凝塊,分為5組,每組血凝塊分別與陰性對照生理鹽水,蠐螬提取物三個濃度組(200μg/ml,400μg/ml,800μg/ml),尿激酶(100 u/m1)孵育。用倒置顯微鏡觀察每組溶液上清中因為血栓溶解釋放出的紅細胞數(shù)量,并拍照。12 h后,再分別根據(jù)血凝塊初始重量和末重之差來計算每組的溶栓率。4.卡拉膠誘導的血栓模型檢測蠐螬提取物抗小鼠尾靜脈血栓作用將32只昆明小鼠隨機分為4組,首先分別給予每組小鼠尾靜脈注射生理鹽水,兩個濃度的蠐螬提取物(20μg/g, 50μg/g),以及尿激酶。2h后,注射0.1%的角叉菜膠誘導尾靜脈血栓形成。24小時過后,統(tǒng)計每組小鼠尾靜脈血栓發(fā)生率,同時用卡尺測量每組內(nèi)發(fā)生血栓的小鼠尾靜脈血栓長度,以觀察蠐螬提取物對小鼠尾靜脈血栓的影響。5.測定蠐螬提取物對纖維蛋白原的降解作用通過SDS-PAGE凝膠電泳,觀測不同濃度的蠐螬提取物對纖維蛋白原的降解作用,以及降解纖維蛋白原的三個亞基的順序6.測定蠐螬提取物對ADP誘導的血小板聚集的抑制作用大鼠心臟采血后用離心的方法獲得貧血小板血漿和富血小板血漿,用血小板聚集儀測定富血小板血漿中加入不同濃度的蠐螬提取物時的聚集曲線,并計算其對5 min內(nèi)對最大聚集率的抑制率。7.測定蠐螬提取物對纖維蛋白的降解作用及其降解方式用瓊脂糖做載體,用凝血酶激活纖維蛋白原變成纖維蛋白,制作成瓊脂糖纖維蛋白平板,再于85℃烘箱中烘烤30 min,制成滅活平板。在做好的纖維蛋白平板上打孔加入樣品,根據(jù)加樣孔周圍有無溶圈形成及比較溶圈大小來判斷蠐螬提取物對纖維蛋白的降解作用及降解方式。8.蠐螬提取物的初步分離純化及纖溶活性物質(zhì)性質(zhì)鑒定蠐螬提取物的S-100HR分離純化后,通過與纖維蛋白原反應后進行凝膠電泳以檢測纖溶活性峰；通過觀察蠐螬提取物與分離材料DEAE sephadex-A50, CM Sephadex-C50的結(jié)合判定其中纖溶活性物質(zhì)為陰離子還是陽離型；用Molish反應鑒定蠐螬提取物中是否含糖類。9.測定蠐螬提取物纖溶活性的影響因素通過SDS-PAGE凝膠電泳,觀測溫度、pH、金屬離子以及蛋白酶抑制劑對其纖溶活性的影響。實驗結(jié)果1.當蠐螬提取物在血漿中的濃度達到25μg/mL以上時,可以明顯延長血漿復鈣化時間,而且延長效果隨著蠐螬提取物濃度的增加而增加,說明其具有良好的體外抗凝活性。2.小鼠尾靜脈出血時間實驗表明,給予小鼠注射蠐螬提取物后,與陰性對照比較,可以明顯延長小鼠尾靜脈出血時間,說明其具有良好的體內(nèi)抗凝活性。3.在蠐螬提取物對血液形成的體外血凝塊的溶解實驗中,隨著蠐螬提取物濃度的升高,因為溶解血凝塊而釋放出來的血紅細胞數(shù)量明顯成增多趨勢,而且在12h后,測定的實驗組的血凝塊溶解率也明顯高于陰性對照組,這表明蠐螬提取物可以溶解體外血凝塊,也說明其具有良好的體外溶栓活性。4.蠐螬提取物可以明顯的降低角叉菜膠誘導小鼠尾靜脈血栓發(fā)生率,同時可減短小鼠尾部血栓長度,說明其具有良好的體內(nèi)抗血栓活性。5.凝膠電泳實驗表明,蠐螬提取物可以降解纖維蛋白原,而且對與纖維蛋白原三個亞基均有降解作用,同時對于三個亞基的降解順序依次為α→β→γ,推測蠐螬提取物通過降解纖維蛋白原發(fā)揮抗凝作用。6.蠐螬提取物可以輕度抑制ADP誘導的大鼠血漿聚集7.在滅活纖維蛋白平板試驗中結(jié)果顯示,蠐螬提取物周圍形成溶圈,表明蠐螬提取物自身可以降解纖維蛋白,并且降解作用也是隨著濃度的增加而增加,但蠐螬提取物不能激活纖溶酶原,因此蠐螬提取物是通過自身降解纖維蛋白而發(fā)揮溶栓作用。8.蠐螬提取物纖溶性物質(zhì)經(jīng)S-100HR分離純化后在Ⅱ峰,纖溶性物質(zhì)為陰離子型,且不含糖類。9.蠐螬提取物纖溶活性物質(zhì)在75℃以上失活,說明為蛋白酶類,并且其纖溶活性可以被絲氨酸蛋白酶抑制劑部分抑制,EDTA對其纖溶活性無影響,說明其纖溶活性成分含有絲氨酸蛋白酶但不含金屬蛋白酶：并且其在(pH3.0～pH10.0)范圍內(nèi)均能保持活性,而且各種金屬離子(Mg2+,Ca2+,Zn2+,Fe2+ Fe2+, Cu2+)對其纖溶活性幾乎無影響。結(jié)論1.蠐螬提取物可以延長血漿復鈣化時間和小鼠尾靜脈出血時間,同時可以溶解體外血凝塊,這說明其具有良好的抗凝和溶栓活性,從而達到活血化瘀功效。2.蠐螬提取物主要通過降解纖維蛋白原和直接降解纖維蛋白而發(fā)揮抗凝溶栓的作用。其對纖維蛋白原的三條鏈均有降解作用,并且降解順序為α→β→γ；但不能激活纖溶酶原而是通過直接降解纖維蛋白而發(fā)揮溶栓作用。3.蠐螬的纖溶活性物質(zhì)含有絲氨酸蛋白酶但不含金屬蛋白酶,常見金屬離子和pH (pH3.0～pH10.0)對其纖溶活性影響較小。
【關鍵詞】：蠐螬 抗凝溶栓 纖維蛋白原
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R285.5
【目錄】：

• 摘要4-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-28
• 第一章 蠐螬提取物體內(nèi)外抗凝溶栓效果評價28-42
• 一、實驗材料及儀器28-29
• 二、實驗方法29-32
• 三、實驗結(jié)果32-42
• 第二章 蠐螬提取物抗凝溶栓的機制研究42-52
• 一、實驗材料及設備42-43
• 二、實驗方法43-45
• 三、實驗結(jié)果45-52
• 第三章 蠐螬提取物纖溶性成分性質(zhì)鑒定52-66
• 一、實驗材料及儀器52-53
• 二、實驗方法53-56
• 三、實驗結(jié)果56-66
• 第四章 討論66-71
• 結(jié)論71-72
• 參考文獻72-77
• 論文發(fā)表情況77-78
• 縮寫詞中英文對照表78-79
• 致謝79-80

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 闞飛;孫捷;田路e

本文編號：394088