本文關(guān)鍵詞：丹酚酸B對(duì)局灶性腦缺血小鼠抑制自噬及凋亡機(jī)制的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:腦血管病是導(dǎo)致我國成人殘疾和死亡的第一原因,其中以缺血性腦血管病最為常見。腦缺血后繼發(fā)性腦損傷是病情加重及影響預(yù)后的重要原因,氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及線粒體功能異常、鈣超載、興奮氨基酸毒性、自噬等因素均有參與。缺血性腦血管病機(jī)制復(fù)雜不明,目前缺乏有效治療手段,是亟待解決的醫(yī)學(xué)問題。急性局灶腦缺血中,氧化應(yīng)激可介導(dǎo)梗死區(qū)域繼發(fā)性神經(jīng)元死亡。自噬在缺血再灌注情況下是一把雙刃劍,細(xì)胞可啟動(dòng)適度的自噬來清除受損細(xì)胞器及異常折疊蛋白質(zhì),對(duì)細(xì)胞起到重要的保護(hù)作用,但不完全或過度自噬現(xiàn)象可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。近來越來越多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明,氧化應(yīng)激能誘導(dǎo)自噬的發(fā)生,并且,應(yīng)用抗氧化劑能抑制自噬并減少細(xì)胞死亡。丹酚酸B(Salvianolic acid B,Sal B)是一種提取自丹參的水溶性單體成分,具有強(qiáng)大的抗氧化作用及其他多種生物學(xué)活性。Sal B可以通過抑制凋亡的機(jī)制保護(hù)缺血心肌細(xì)胞,也有文獻(xiàn)報(bào)道Sal B可通過抑制自噬來保護(hù)饑餓狀態(tài)的心肌細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)旨在研究Sal B這一氧自由基清除劑對(duì)急性期局灶性腦缺血小鼠是否存在腦保護(hù)作用,且其作用機(jī)制是否為抑制凋亡及自噬水平。方法:采用雄性CD1小鼠(體重25-30g),應(yīng)用改良Longa法建立小鼠右側(cè)p MCAO模型。實(shí)驗(yàn)分為三部分:實(shí)驗(yàn)一:探究Sal B對(duì)急性期局灶性腦缺血小鼠的腦保護(hù)作用小鼠隨機(jī)分為4組:Sham組(Sham+生理鹽水)、p MCAO組(p MCAO+生理鹽水)、丹酚酸B低劑量組(p MCAO+Sal B 10mg/kg,Sal-L)、丹酚酸B高劑量組(p MCAO+Sal B 25mg/kg,Sal-H)。各組小鼠按照統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行麻醉與造模,造模成功后,藥物干預(yù)組即刻腹腔注射Sal B,Sham組和p MCAO組用則給予等量生理鹽水。術(shù)后24 h采用Longa法及Clark法對(duì)小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。評(píng)分完畢后將動(dòng)物斷頭處死,用干濕重法測(cè)定腦組織含水量,用TTC染色法測(cè)定腦梗死體積,用伊文斯蘭染色法測(cè)定血腦屏障通透性,用western blot測(cè)定緊密連接蛋白Claudin-5的含量,用尼氏染色法測(cè)定梗死交界區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷情況,用電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)改變(梗死皮層超微結(jié)構(gòu)如自噬體的形成、細(xì)胞凋亡情況和微血管損傷情況等)。實(shí)驗(yàn)二:局灶性腦缺血小鼠各因子分區(qū)表達(dá)對(duì)Sham及p MCAO組小鼠于術(shù)后24h行免疫組織化學(xué)染色測(cè)定LC3、beclin1、p62、bcl2、bax、Caspase-3的陽性細(xì)胞分布情況及計(jì)數(shù)情況。行免疫熒光染色觀察beclin1及Caspase-3是否存在共標(biāo)。觀察western blot測(cè)定PGC-1α及Sirt1的分區(qū)表達(dá)。實(shí)驗(yàn)三:Sal B腦保護(hù)作用機(jī)制的探究首先,根據(jù)因子分區(qū)表達(dá)情況選定測(cè)定的分區(qū):LC3、beclin1、p62于梗死周邊區(qū)觀察;bcl2、bax、cleaved Caspase-3于梗死中心區(qū)觀察。應(yīng)用western blot及RT-q PCR進(jìn)行測(cè)定Sham組、p MCAO組、Sal-L組、Sal-H組相應(yīng)分區(qū)各因子的蛋白、m RNA含量的變化。對(duì)不同分區(qū)凋亡相關(guān)信號(hào)通路重要因子MAPKs及能量代謝通路重要因子PGC-1α及Sirt1行western blot及RT-q PCR測(cè)定其蛋白、m RNA含量的變化。用DHE染色測(cè)定梗死側(cè)皮層ROS的生成量,分別應(yīng)用MDA含量及SOD活力試劑盒測(cè)定梗死皮層脂質(zhì)過氧化程度及機(jī)體清除氧自由基的能力。總之,分別從凋亡、自噬、氧化應(yīng)激三方面探討丹酚酸B腦保護(hù)作用機(jī)制。結(jié)果:1丹酚酸B對(duì)急性期局灶性腦缺血小鼠具有保護(hù)作用1.1丹酚酸B改善行為學(xué)評(píng)分p MCAO術(shù)后24 h,分別采用Longa法及Clark法對(duì)各組小鼠進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分,對(duì)此采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)并分析結(jié)果。采用Longa評(píng)分法及Clark評(píng)分法時(shí),與p MCAO組相比,Sal-L組和Sal-H組的神經(jīng)功能評(píng)分明顯改善,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。1.2丹酚酸B降低腦梗死體積p MCAO術(shù)后24 h,Sal-L組和Sal-H組因藥物干預(yù)梗死體積明顯減小,且差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Sal-L組和Sal-H組vs.p MCAO組:51.09%±12.65%和34.31%±7.93%vs.65.94%±2.96%,P0.05)。1.3丹酚酸B保護(hù)血腦屏障1.3.1丹酚酸B減輕腦水腫:p MCAO術(shù)后24 h,Sal-L組和Sal-H組梗死側(cè)腦組織含水量較p MCAO組明顯減少(P0.05)。1.3.2丹酚酸B降低血腦屏障通透性:局灶性腦缺血后24h,Sal-L組和Sal-H組右側(cè)大腦半球腦組織伊文斯蘭含量均明顯低于p MCAO組(P0.05)。1.3.3丹酚酸B上調(diào)Claudin5表達(dá):局灶性腦缺血后24h p MCAO組右側(cè)大腦半球Claudin5蛋白表達(dá)量降低,與Sham組比較有差異(P0.05)。p MCAO組左側(cè)半球與Sham組的Claudin5蛋白含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。應(yīng)用Sal B干預(yù)后,Claudin5含量增加,緊密連接崩解減少,血腦屏障受到保護(hù)。1.3.4丹酚酸B保護(hù)血腦屏障超微結(jié)構(gòu)取右側(cè)大腦半球皮層行電鏡檢測(cè),結(jié)果顯示:除Sham組外均有不同程度內(nèi)皮細(xì)胞受損,細(xì)胞核增大,緊密連接開放,基底膜模糊,可見紅細(xì)胞阻塞微血管,管周有液體滲出,周圍腦組織細(xì)胞水腫。p MCAO組最為嚴(yán)重,周圍組織高度水腫;Sal-H組較p MCAO組管周液體滲出減少,緊密連接較完好且基底膜更為完整。1.4丹酚酸B減少神經(jīng)細(xì)胞損傷1.4.1丹酚酸B增加尼氏染色中存活細(xì)胞數(shù)目,Sal-L組和Sal-H組較p MCAO組存活細(xì)胞數(shù)目增多(P0.05)。1.4.2丹酚酸B改善組織超微結(jié)構(gòu),同時(shí)還可觀察到局灶性腦缺血后的自噬現(xiàn)象,p MCAO組小鼠梗死灶周圍皮層可見直徑平均500nm的雙層膜的自噬小體。2局灶性腦缺血后不同區(qū)域因子表達(dá)變化不同2.1 p MCAO及Sham術(shù)后24小時(shí),Caspase-3、bax、bcl2的免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示Sham組bax及Caspase-3表達(dá)量很少,bcl2作為抗凋亡因子在正常組織中有一定程度的表達(dá)。梗死對(duì)側(cè)皮層組各因子陽性細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)與Sham組無明顯差異;梗死中心皮層組Caspase-3及bax表達(dá)明顯上升,陽性細(xì)胞數(shù)目顯著增多(Core vs.Sham,P0.05),bcl2表達(dá)明顯下調(diào),陽性細(xì)胞數(shù)目減少(Core vs.Sham,P0.05);梗死周邊皮層組Caspase-3及bax表達(dá)有所上調(diào)且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)但幅度遠(yuǎn)小于梗死中心皮層,bcl2表達(dá)上調(diào)且陽性細(xì)胞數(shù)增多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。pMCAO組中,梗死中心皮層組各自噬相關(guān)指標(biāo)幾乎未見陽性細(xì)胞,與Sham組有顯著差別,梗死對(duì)側(cè)皮層組自噬相關(guān)指標(biāo)陽性細(xì)胞數(shù)目與Sham組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。梗死周邊皮層自噬水平顯著提高,LC3、beclin1及p62表達(dá)均顯著上升(P0.05)。2.2免疫熒光顯示beclin1+與Caspase-3+細(xì)胞有明顯分界,未觀察到存在了beclin1+/Caspase-3+細(xì)胞。2.3腦缺血組織分區(qū):將腦皮層分為梗死對(duì)側(cè)皮層(Contralateral),梗死周邊皮層(Pericore)及梗死中心皮層(Core)。Core組PGC-1α及Sirt1蛋白表達(dá)水平較sham組明顯下調(diào),pericore組及contralateral組則較sham組上升。3丹酚酸B腦保護(hù)作用機(jī)制的探究3.1丹酚酸B的抗氧化作用:Sal B通過清除ROS、降低梗死半球腦組織MDA含量并恢復(fù)SOD活性來抗氧化。3.2丹酚酸B的抗凋亡作用:術(shù)后24小時(shí),western blot結(jié)果顯示Cleaved Caspase-3/GADPH及bax/bcl2比值較Sham組明顯升高。Sal-L組和Sal-H組較p MCAO組的Cleaved Caspase-3/GADPH及bax/bcl2比值明顯降低。RT-q PCR結(jié)果符合組織化學(xué)染色結(jié)果。用藥后,Sal-L和Sal-H的Caspase-3及bax基因表達(dá)降低且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3.3丹酚酸B抑制自噬的作用自噬相關(guān)指標(biāo)在蛋白表達(dá)層面包括LC3II/GADPH、beclin1/GADPH及p62/GADPH;其相對(duì)應(yīng)基因表達(dá)層面包括MAP1LC3b/ACTB、BECN1/ACTB及SQSTM1/ACTB。低劑量的Sal B干預(yù)可明顯降低各個(gè)指標(biāo)的表達(dá)量,高劑量效果較之稍遜色。與western blotting結(jié)果一致,p MCAO組各指標(biāo)m RNA的表達(dá)較Sham組明顯增加。與p MCAO組相比,Sal-L組各指標(biāo)的表達(dá)量明顯減少,高劑量較之效果遜色,與Western blot結(jié)果一致。3.4丹酚酸B下調(diào)梗死中心皮層p-p38及p-erk1/2表達(dá)3.5丹酚酸B上調(diào)梗死周圍皮層Sirt1-PGC-1α通路的蛋白及基因表達(dá)結(jié)論:Sal B對(duì)急性期局灶性腦缺血小鼠的具有腦保護(hù)作用,可以改善神經(jīng)功能缺損評(píng)分(Longa法及Clark法),降低梗死體積,保護(hù)血腦屏障,增加增加尼氏染色中存活細(xì)胞數(shù)目以及改善組織超微結(jié)構(gòu)。局灶性腦缺血中可觀察到細(xì)胞自噬現(xiàn)象,可見典型自噬體形成及自噬溶酶體的形成,也可觀察到典型的細(xì)胞凋亡。免疫組織化學(xué)檢測(cè)自噬相關(guān)因子及凋亡相關(guān)因子的表達(dá)及分布,發(fā)現(xiàn)兩者分布不同。自噬相關(guān)指標(biāo)于梗死周邊皮層表達(dá)上調(diào)(如LC3及beclin1),凋亡相關(guān)指標(biāo)主要于梗死中心皮層明顯變化(如cleaved Caspase-3及bax上調(diào),bcl2下調(diào)),且Beclin1及Caspase-3進(jìn)行雙標(biāo)免疫熒光染色時(shí)未見共標(biāo)。說明應(yīng)分區(qū)討論于是取不同部位皮層進(jìn)行蛋白及基因水平檢測(cè)。Sal B可于pericore區(qū)抑LC3II及beclin1表達(dá),但p62表達(dá)也減少并未堆積,說明自噬水平雖然降低,但自噬溶酶體仍能降解底物,說明Sal B抑制了過度激活的自噬水平。Sirt1-PGC-1α也在此區(qū)域明顯激活,有利于能量代謝順利進(jìn)行,減少損傷的線粒體,從而減低自噬的刺激物。自噬水平的降低可能是由于Sirt1-PGC-1α激活致使ROS生成減少所致。Sal B可于core區(qū)抑制凋亡,bax/bcl2及cleaved Caspase-3下調(diào)。此抗凋亡作用可能是通過p-erk1/2及p-p38的蛋白表達(dá)下調(diào)所致。
【關(guān)鍵詞】：腦缺血 丹酚酸B 凋亡 自噬 活性氧
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R285.5
【目錄】：

• 中文摘要4-9
• 英文摘要9-14
• 英文縮寫14-16
• 前言16-17
• 材料與方法17-34
• 結(jié)果34-42
• 附圖42-52
• 討論52-54
• 結(jié)論54
• 參考文獻(xiàn)54-58
• 綜述 缺血半暗帶概念的進(jìn)展58-61
• 參考文獻(xiàn)59-61
• 致謝61-63
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷63

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本文編號(hào)：337604