本文關鍵詞：晚期氧化蛋白產(chǎn)物對兔膝骨關節(jié)炎關節(jié)軟骨及滑膜影響的實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景骨關節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是一種常見的慢性退行性關節(jié)疾病,典型的病理改變包括軟骨的降解、滑膜的炎癥、骨贅形成以及軟骨下骨骨重塑等,因此它也是一種累及全關節(jié)的疾病。流行病學調查未發(fā)現(xiàn)其有明顯的種族與地域性差異。在50歲以上的人群中,骨關節(jié)炎的致殘比例約為2%～6%,這一比例在導致長期殘疾的人類疾病中僅次于心血管疾病。由于其在中老年人中的發(fā)病率和致殘率較高,骨關節(jié)炎被認為是影響人類健康最常見的疾病之一。據(jù)美國調查機構統(tǒng)計,因骨關節(jié)炎導致的醫(yī)療費用開支和其他經(jīng)濟損失年均高達1500億美元,而其中一半以上消耗源于骨關節(jié)炎患者勞動能力的喪失。骨關節(jié)炎患者最主要的臨床癥狀為關節(jié)疼痛,因而較其它關節(jié)疾病而言,骨關節(jié)炎更加容易限制患者的下肢運動能力,從而導致患者的長期勞動能力喪失,最終阻礙了社會與經(jīng)濟的發(fā)展。膝關節(jié)骨性關節(jié)炎(knee osteoarthritis, KOA)在骨關節(jié)炎中較常見,是一種慢性進行性骨關節(jié)病,多見于中老年人。據(jù)國外統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)55～64歲的中老年人發(fā)病率高達40%。KOA病理改變主要為關節(jié)軟骨基質崩解以及軟骨細胞數(shù)量的減少。隨著對膝骨關節(jié)炎的研究不斷深入,越來越多的致病因素被發(fā)現(xiàn),然而其病因及病理機制卻仍不明確。各種因素導致的關節(jié)軟骨損傷在生物學和形態(tài)學上高度一致,病變常常波及整個關節(jié),包括關節(jié)軟骨、軟骨下骨、滑膜、關節(jié)滑液甚至韌帶和周圍的肌肉組織。膝骨關節(jié)炎發(fā)展的最終結果是關節(jié)正常結構的破壞以及關節(jié)功能的喪失,臨床上患者常常因劇痛難忍而長期無法進行下肢活動。這些既影響了患者的生活質量也阻礙了社會的發(fā)展。因此,明確骨關節(jié)炎的發(fā)病機制對整個OA的防控工作具有越來越重要的意義。人體內(nèi)氧化還原反應失衡導致活性氧類物質(Reactive Oxygen Species,ROS)積聚,最終引發(fā)氧化應激。機體在氧化應激狀態(tài)下,大分子結構物質如蛋白質、脂質、DNA、RNA等因遭受氧化損傷而喪失正產(chǎn)的結構和功能,其中最易受到損傷的是蛋白質。而晚期氧化蛋白產(chǎn)物(Advanced Oxidation Protein Products, AOPPs)主要就是由體內(nèi)血漿中白蛋白在氧化應激狀態(tài)下經(jīng)氧化修飾而生成的一種雙酪氨酸蛋白交聯(lián)物,AOPPs最早被發(fā)現(xiàn)是在慢性腎功能衰竭(Chronic Renal Failure,CRF)的患者血漿中,最終證實其主要是由血清中的白蛋白被機體內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基和反應性氧氧化而生成。臨床進一步研究發(fā)現(xiàn),慢性腎衰竭患者以及進行過血液透析的患者體內(nèi)均存在較常人更高濃度的AOPPs,且與上述疾病與相關的長期并發(fā)癥存在直接關系。經(jīng)實驗證實,晚期氧化蛋白產(chǎn)物也能在體外進行合成,通過血漿或純化的血清白蛋白經(jīng)次氯酸氧化反應即可得到,且加入的次氯酸劑量與晚期氧化蛋白產(chǎn)物生成濃度呈正相關性。蛋白被氧化后會生成一種特有的雙酪氨酸結構,人體血漿中晚期氧化蛋白產(chǎn)物濃度與雙酪氨酸及蛋白質糖基化標志物戊糖苷濃度呈正比,因此可以認為晚期氧化蛋白產(chǎn)物是一種良好的氧化應激標志物,可特異性的評價蛋白質受氧化的程度。近十幾年的研究發(fā)現(xiàn),晚期氧化蛋白產(chǎn)物除了在尿毒癥患者體內(nèi)集聚外,它還與眾多疾病相關。其中在對血液透析患者的實驗研究發(fā)現(xiàn)此類患者血漿中的晚期氧化蛋白產(chǎn)物濃度與頸動脈內(nèi)膜中層厚度呈明顯的相關性。同時又有研究發(fā)現(xiàn)慢性腎臟疾病(Chronic Kidney Disease, CKD)患者早期血漿中的晚期氧化蛋白產(chǎn)物濃度即顯著升高,并隨著腎功能惡化而進行性升高。Piwowar等發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者血漿晚期氧化蛋白產(chǎn)物濃度明顯高于正常人,并與體內(nèi)氧化及抗氧化標記物濃度呈相關性,研究還進一步發(fā)現(xiàn)有微血管病變的糖尿病患者,其血漿晚期氧化蛋白產(chǎn)物濃度也明顯高于無病變患者。在對冠心病人群進行的一項研究中發(fā)現(xiàn),冠心病患者血液中晚期氧化蛋白產(chǎn)物濃度明顯高于正常人,并與冠心病的嚴重程度呈相關性,被認為是冠心病的一個獨立危險因素。研究還發(fā)現(xiàn)冠心病病人血漿中晚期氧化蛋白產(chǎn)物與巰基比例明顯升高,此研究認為晚期氧化蛋白產(chǎn)物與巰基比例升高可作為急性冠脈綜合征發(fā)作的標志。過往文獻報道有許多人類疾病都與晚期氧化蛋白產(chǎn)物的蓄積相關,如過敏性紫癜、IgA腎病、慢性炎癥性腸病、肥胖、非酒精性脂肪肝、急性消化性潰瘍等。臨床上的研究促使學者們產(chǎn)生了對晚期氧化蛋白產(chǎn)物的興趣,越來越多的動物實驗被用來驗證晚期氧化蛋白產(chǎn)物的作用。在一項大鼠在體實驗研究中發(fā)現(xiàn)晚期氧化蛋白產(chǎn)物能刺激糖尿病大鼠腎臟組織內(nèi)單核細胞趨化因子(Monocyte Chemotactic Protein-1)、轉化生長因子(Transforming Growth Factor-β,TGF-β)等促炎細胞因子的合成與釋放,最終導致腎單位結構破壞,尿蛋白排出量增加及血肌酐升高。另一項兔的在體實驗證實晚期氧化蛋白產(chǎn)物能促進正常新西蘭白兔大動脈壁產(chǎn)生細胞炎癥和脂滴沉積,加速了高脂血癥新西蘭大白兔兔大動脈粥樣斑塊的形成。通過上述動物在體實驗研究發(fā)現(xiàn),在晚期氧化蛋白產(chǎn)物干預下,干預對應的組織中活性氧自由基均明顯升高。Witko-Sarsat等通過體外實驗研究進一步對晚期氧化蛋白產(chǎn)物的作用機制進行了探究,實驗發(fā)現(xiàn)晚期氧化蛋白產(chǎn)物能通過激活單核細胞誘導呼吸鏈爆發(fā),從而產(chǎn)生氧化應激。此后又有研究證實不論是慢性腎衰和糖尿病患者體內(nèi)的晚期氧化蛋白產(chǎn)物,還是體外通過次氯酸氧化蛋白而產(chǎn)生的晚期氧化蛋白產(chǎn)物,它們均可通過細胞表面的晚期糖基化產(chǎn)物受體(Receptor of Advanced Glycation End Products, RAGE)介導的、ROS敏感的MAPK和NF-kB信號通路激活人血管內(nèi)皮細胞。除上述作用機制以外,研究還發(fā)現(xiàn)晚期氧化蛋白產(chǎn)物能促使腎小球系膜細胞內(nèi)形成超氧化物,最終導致轉化生長因子(Transforming growth factor-β, TGF-β)的合成增加,并上調纖維蛋白和Ⅳ型膠原纖維基因及蛋白的表達,導致系膜細胞外基質沉積。晚期氧化蛋白產(chǎn)物還可介導腎臟足細胞損傷和凋亡,誘導心肌細胞死亡等。因此,晚期氧化蛋白產(chǎn)物不僅是氧化應激的后果,其本身也是活性氧自由基的來源,作為一種重要的大分子炎癥介質具有廣泛的病理作用,可能參與人類多種重要疾病的發(fā)生、發(fā)展。雖然骨關節(jié)炎的致病因素多種多樣,但經(jīng)過大量的研究后發(fā)現(xiàn)有兩種因子與骨關節(jié)炎聯(lián)系最為緊密,即基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)與白介素(Interleukin)。在骨關節(jié)炎相關的研究中發(fā)現(xiàn)無論是基質金屬蛋白酶還是白介素,都參與關節(jié)軟骨基質的代謝活動。軟骨基質的降解更是與基質金屬蛋白酶存在最直接的關系。MMPs是一種蛋白水解酶,但它的作用不僅僅局限在降解蛋白質,MMPs家族中的某些酶還能夠特異性的降解細胞外基質(extra cenularmatrix,ECM)。如MMP-3,它屬于基質分解素類的酶,廣泛存在與各種組織中,主要作用是降解Ⅳ型膠原和蛋白聚糖以及與細胞內(nèi)粘性相關的層粘連蛋白、纖維連接蛋白。還有MMP-13,它屬于間質膠原酶類,能夠特異性的降解膠原,包括軟骨中廣泛存在的Ⅱ型膠原就是其底物之一。本課題組前期研究證實了晚期氧化蛋白產(chǎn)物能通過NADPH氧化酶依賴的NF-κB通道誘導小鼠成纖維樣滑膜細胞的炎癥反應,使滑膜細胞中MMP-3與MMP-13表達上調。同時我們也證實了晚期氧化蛋白產(chǎn)物能通過刺激ROS的生成而抑制成骨樣細胞的增值與分化。然而晚期氧化蛋白產(chǎn)物否在骨關節(jié)炎發(fā)生發(fā)展過程中對軟骨和滑膜產(chǎn)生影響尚不清楚。因此我們假設晚期氧化蛋白產(chǎn)物在骨關節(jié)炎的病程中亦能對軟骨和滑膜產(chǎn)生不利影響,其有能是骨關節(jié)炎發(fā)病的重要因素之一。為了證實上述假設,本研究采用新西蘭大白兔行膝關節(jié)前交叉韌帶離斷與內(nèi)側半月板部分切除術建立骨關節(jié)炎模型后于關節(jié)腔內(nèi)注射一定濃度晚期氧化蛋白產(chǎn)物,觀察并分析關節(jié)軟骨的大體形態(tài),滑膜的相關蛋白表達,探討氧化修飾蛋白質對關節(jié)軟骨、滑膜組織的病理學作用及其與骨關節(jié)炎的關系。研究目的1.探討外源性晚期氧化蛋白產(chǎn)物(AOPPs)對兔骨關節(jié)炎關節(jié)軟骨組織大體形態(tài)的影響。2.探討外源性晚期氧化蛋白產(chǎn)物(AOPPs)對滑膜組織中基質金屬蛋白酶表達的影響。研究方法1.體外制備AOPPs修飾的兔血清白蛋白(AOPPs-RSA)。將兔血清白蛋白與次氯酸溶液以摩爾比例1：140混勻后,室溫下反應30min,加入透析膜中并將透析膜在磷酸鹽緩沖液中透析24小時去除游離次氯酸,將所得樣品用濾器過濾去除內(nèi)毒素,經(jīng)鱟實驗法測定內(nèi)毒素含量低于0.25EU/ml。AOPPs-RSA中AOPPs含量的測定：以氯胺T為標準曲線,測定酸性條件下340nm吸光度值。最終將制備好的AOPPs稀釋至0.20mg/ml后保存于-20℃冰箱備用。2.實驗動物的藥物干預及取材。購買5月齡雄性新西蘭大白兔(南方醫(yī)科大學動物實驗中心)48只,體重2.0～2.5kg。飼養(yǎng)于適宜的環(huán)境中,給予充足的水與食物,嚴格晝夜周期。經(jīng)10天適應環(huán)境后將48只雄性新西蘭大白兔隨機分假手術組(Sham-operated)、對照組(ACLT+MMx/PBS)和干預組(ACLT+MMx/AOPPs),每組16只。采用膝關節(jié)前交叉韌帶離斷與內(nèi)側半月板部分切除術(ACLT+MMx)建立骨關節(jié)炎模型。假手術組：采用與造模手術相同的手術入路打開關節(jié)腔,顯露前交叉韌帶后縫合切口。對照組與干預組均采用ACLT+MMx造成骨關節(jié)炎模型。給予2周時間愈合手術傷口后,干預組行l(wèi)ml AOPPs(200μg/ml)隔日關節(jié)腔內(nèi)注射,對照組給予同等劑量磷酸鹽緩沖液關節(jié)腔內(nèi)隔日注射,假手術組不做任何處理。在關節(jié)腔注射開始4w、8w后隨機取每組中的8只經(jīng)麻醉后以耳緣靜脈注射空氣處死,分離雙側股骨及脛骨標本。關節(jié)標本的股骨與脛骨分離后剝除表面軟組織,生理鹽水紗布包埋后儲存于-80℃冰箱備用。3.檢測指標：(1)對膝關節(jié)標本行肉眼大體觀察,取股骨髁作為組織標本,行India ink大體標本染色,并以India ink染色大體評分法對實驗動物關節(jié)損傷進行評價。(2)股骨髁切片行番紅O固綠染色。以Mankin評分為標準,對兔骨關節(jié)炎模型關節(jié)軟骨的損傷進行評價。(3)取關節(jié)內(nèi)滑膜組織為標本,提取滑膜組織中蛋白并通過蛋白印跡實驗(Western-blot)檢測滑膜組織中基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs) MMP-3與MMP-13的表達量。研究結果1. AOPPs組4周和8周India ink染色大體觀察評分分別為(4.19±0.60)、(5.75±0.60),假手術組分別為(1.06±0.18)、(1.38±0.60),磷酸鹽緩沖液組分別為(2.50±0.46)、(3.06±0.62),磷酸鹽緩沖液組的India ink大體評分在兩個時間點上均較假手術組高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05). AOPPs組的India ink染色大體評分在兩個時間點均較另外兩組高,且差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2.組織學觀察AOPPs組4周和8周Mankin評分分別為(8.19±0.70)、(11.94±0.90),假手術組分別為(0.75±0.53)、(1.06±0.73),磷酸鹽緩沖液組分別為(4.25±1.46)、(4.50±0.89),磷酸鹽緩沖液組的Mankin評分在兩個時間點上均高于假手術組,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05). AOPPs組的Mankin評分在兩個時間點上均高于另外兩組,且差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3. AOPPs組4周和8周滑膜組織中MMP-3、MMP-13相對表達量分別為(1.006±0.080)、(1.098±0.088),假手術組分別為(0.066±0.006)、(0.053±0.011),磷酸鹽緩沖液組分別為(0.552±0.024)、(0.839±0.084)。磷酸鹽緩沖液組滑膜組織中MMP-3、MMP-13的表達量在兩個時間點均較假手術組高,且差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。AOPPs組4周和8周滑膜組織中MMP-3、 MMP-13的表達量均較其它兩組高,且差異均具有統(tǒng)計學差異(P0.05)。結論：外源性AOPPs刺激滑膜細胞MMP-3、MMP-13表達上調,加速軟骨退變。
【關鍵詞】：骨關節(jié)炎 晚期氧化蛋白產(chǎn)物 軟骨 滑膜 基質金屬蛋白酶
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R684.3
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-19
• 前言19-28
• 第一章 新西蘭大白兔骨關節(jié)炎模型的建立及AOPPs的制備28-36
• 材料與方法28-34
• 結果34
• 討論34-35
• 結論35-36
• 第二章 晚期氧化蛋白產(chǎn)物對OA軟骨大體形態(tài)的影響36-48
• 材料與方法36-39
• 結果39-45
• 討論45-47
• 結論47-48
• 第三章 晚期氧化蛋白產(chǎn)物對OA滑膜中MMP3、MMP13表達的影響48-56
• 材料與方法48-51
• 結果51-52
• 討論52-55
• 結論55-56
• 全文結論56-57
• 參考文獻57-66
• 攻讀學位期間成果66-67
• 附錄 中英文對照縮略詞表67-68
• 致謝68-70

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 葉丹麗;劉慶;胡昕;;滑膜在骨關節(jié)炎發(fā)病中的作用研究進展[J];北方藥學;2014年02期

2 Jie Shen;Shan Li;Di Chen;;TGF-，

本文編號：335323