本文關(guān)鍵詞：拉布拉多犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與牙周膜基質(zhì)干細(xì)胞裸鼠皮下成骨能力的比較性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:通過體外加入骨向誘導(dǎo)液進(jìn)行培養(yǎng),觀察比較犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)和牙周膜基質(zhì)干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)的形態(tài)特征及兩者在體外成骨能力的差異;再分別與支架材料β-磷酸三鈣(β-TCP)復(fù)合并植入裸鼠皮下后,探索拉布拉多犬BMSCs和拉布拉多犬PDLSCs異位成骨能力的差異。方法:(1)犬BMSCs的培養(yǎng):成年拉布拉多犬一只,將犬髂后上棘去毛后消毒,鋪巾,待麻醉起效后,用骨髓穿刺針于犬髂后上棘穿刺抽取骨髓于離心管中,低速離心后將其接種于培養(yǎng)皿中,加入DMEM。待細(xì)胞培養(yǎng)至第3代后,取生長狀態(tài)良好者,加入成骨向分化誘導(dǎo)液進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng);(2)犬PDLSCs的培養(yǎng)取成年拉布拉多犬一只,消毒鋪巾麻醉起效后,拔取左下頜三顆下前牙,用PBS緩沖液從根尖向牙冠方向反復(fù)沖洗多次,用銳利手術(shù)刀片刮取牙根中部1/3的牙周膜組織,剪碎后接種于培養(yǎng)皿中,添加適量DMEM,待細(xì)胞培養(yǎng)至第3代后,取生長狀態(tài)良好者,加入成骨向分化誘導(dǎo)液進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng)。(3)檢測方法:MTT法檢測兩種基質(zhì)干細(xì)胞的增殖差異;骨向誘導(dǎo)后1d、4d、7d、14d及21d,采用堿性磷酸酶(ALP)染色法和茜素紅(ARS)染色法法檢測兩者成骨分化情況;骨向誘導(dǎo)后1d、4d、7d、14d及21d,RT-PCR檢測成骨誘導(dǎo)后成骨相關(guān)基因表達(dá)情況。取誘導(dǎo)培養(yǎng)7d后的第三代拉布拉多犬BMSCs和拉布拉多犬PDLSCs,分別與2mm×Φ6mmβ-TCP復(fù)合。實(shí)驗(yàn)分為3組,即β-TCP組,犬BMSCs/β-TCP復(fù)合體組,犬PDLSCs/β-TCP復(fù)合體組。將細(xì)胞體外與材料復(fù)合后,常規(guī)培養(yǎng)3d,利用掃描電鏡觀察細(xì)胞與材料的黏附情況。并將各組復(fù)合物植入裸鼠皮下,裸鼠常規(guī)飼養(yǎng)8周后取材,通過HE染色觀察新骨形成情況,免疫組化檢測成骨相關(guān)基因蛋白的表達(dá)。結(jié)果:(1)BMSCs原代培養(yǎng)7d后,在顯微鏡下觀察可見有細(xì)胞爬出,并大量增殖,細(xì)胞呈長梭狀;(2)PDLSCs原代培養(yǎng)7d后,顯微鏡下觀察可見有大量細(xì)胞從牙周膜組織塊中爬出,成放射狀分布,細(xì)胞呈長梭狀。兩者在細(xì)胞形態(tài)上無明顯差異;(3)MTT檢測顯示兩者均有良好的體外增殖能力,其中BMSCs的增殖能力稍強(qiáng);(4)ALP和ARS的染色結(jié)果顯示兩者隨誘導(dǎo)時(shí)間的增加均有陽性顯色,且陽性染色結(jié)果漸強(qiáng),同一時(shí)間點(diǎn)BMSCs的染色比PDLSCs的深;(5)RT-PCR結(jié)果顯示,在成骨誘導(dǎo)的過程中,成骨誘導(dǎo)相關(guān)基因BMP2、OCN、RUNX2、HIF-1α、VEGF、CLOOAGEN-1等都有明顯的表達(dá),與PDLSCs組相比,BMSC組BMP2基因在骨誘導(dǎo)1d表達(dá)顯著高于PDLSCs組(P0.01)但在骨誘導(dǎo)的7d和14d PDLSCs組BMP2基因表達(dá)要高于BMSC組(P0.01)。BMSCs組OCN基因,基因在骨誘導(dǎo)14d時(shí)表達(dá)明顯強(qiáng)于PDLSCs組(P0.01)。RUNX2兩組中都有高表達(dá)但是結(jié)果顯示無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。BMSCs組HIF-1α,基因在骨誘導(dǎo)4d時(shí)表達(dá)明顯低于PDLSCs組(P0.01)。COLLAGEN-1 BMSCs組基因在骨誘導(dǎo)1d、4d、7d及14d時(shí)表達(dá)明顯高于PDLSCs組(P0.01)。掃描電鏡結(jié)果表明犬BMSCs和犬PDLSCs均可在β-TCP支架材料上正常生長。兩種細(xì)胞均以較高的細(xì)胞密度生長于β-TCP表面及孔隙中,與骨架材料結(jié)合較好。裸鼠皮下組織切片HE染色結(jié)果顯示,犬BMSCs和犬PDLSCs組都有新生骨樣組織形成,免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,犬BMSCs組BMP-2和OCN表達(dá)量略高于犬PDLSCs組。結(jié)論:BMSCs和犬PDLSCs經(jīng)體外誘導(dǎo)后都具有一定的成骨性能,其中BMSCs的成骨能力較PDLSCs的成骨能力強(qiáng)。
【關(guān)鍵詞】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 牙周膜基質(zhì)干細(xì)胞 β-磷酸三鈣 裸鼠 異位成骨
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R781
【目錄】：

• 縮略詞表5-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 前言11-14
• 材料與方法14-30
• 第一部分 材料與試劑14-20
• 1 材料與試劑14-16
• 2 儀器與設(shè)備16-17
• 3 試劑的配置方法17-20
• 第二部分 實(shí)驗(yàn)方法20-30
• 1 犬BMSCs和PDLSCs的體外分離培養(yǎng)和生物學(xué)特性的鑒定20-28
• 1.1 實(shí)驗(yàn)方法20-25
• 1.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果25-28
• 2 犬BMSCs和PDLSCs的成骨能力比較的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)28-30
• 2.1 試驗(yàn)方法28-29
• 2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-30
• 討論30-31
• 結(jié)論31-32
• 參考文獻(xiàn)32-36
• 附圖36-42
• 附錄 個(gè)人簡歷42-43
• 致謝43-44
• 綜述44-54
• 參考文獻(xiàn)51-54

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本文編號(hào)：332209