本文關(guān)鍵詞：電針預(yù)處理通過MMP9調(diào)節(jié)TJP誘導(dǎo)大鼠腦缺血耐受的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景根據(jù)《2014年中國(guó)衛(wèi)生和計(jì)劃生育統(tǒng)計(jì)年鑒》公布的結(jié)果,缺血性腦卒中依然是威脅我國(guó)國(guó)民健康的主要疾病之一。結(jié)合我國(guó)現(xiàn)階段醫(yī)療情況,其具有發(fā)病率高、患病率高、致殘率高和死亡率高的特點(diǎn),給社會(huì)造成沉重負(fù)擔(dān)[1]。而目前臨床對(duì)于卒中的治療主要是依靠組織型纖溶酶原激活物(t PA),但由于嚴(yán)格的治療時(shí)間窗、出血風(fēng)險(xiǎn)及知情同意等諸多限制,絕大部分患者沒有得到及時(shí)有效的治療[2]。因此,研究缺血性卒中發(fā)生機(jī)制并尋找新的治療措施成為亟需解決的問題�；|(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)作為基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)超家族的成員之一,目前大量的研究證實(shí)其在被激活后通過參與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解過程,與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[3]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中MMP9被認(rèn)為是與腦微血管疾病關(guān)系最為密切的酶之一[4]。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑可逆轉(zhuǎn)缺血后緊密連接蛋白(TJP)的降解作用,使腦水腫程度明顯減輕[5]。這一結(jié)果提示血腦屏障(BBB)組成成分的TJP與MMP9可能存在某種聯(lián)系。而另一研究發(fā)現(xiàn)敲除MMP9基因的小鼠,腦缺血后的梗死容積顯著降低[6]。此外,有試驗(yàn)通過腹腔內(nèi)注射褪黑素使大鼠缺血再灌注損傷后腦內(nèi)MMP9的水平明顯降低,BBB破壞較輕,腦水腫程度改善[7]。這一系列結(jié)果說明,腦卒中后MMP9水平的升高與活化會(huì)促使TJP降解,引起B(yǎng)BB通透性改變導(dǎo)致腦水腫,加重腦組織損傷。而采取有效措施降低卒中后MMP9的表達(dá)與活化將有助于減輕TJP降解,從而緩解腦水腫,改善卒中轉(zhuǎn)歸。中樞神經(jīng)系統(tǒng)在缺血再灌注損傷后有著錯(cuò)綜復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制,我科多年來致力于電針的腦保護(hù)作用研究,本課題組前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明:電針預(yù)處理的神經(jīng)保護(hù)作用與腦組織內(nèi)MMP9的水平與活性密切相關(guān)[8]。但對(duì)這一現(xiàn)象潛在的細(xì)胞分子轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚不清楚,因此進(jìn)一步探索電針預(yù)處理的腦保護(hù)機(jī)制將有助于發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)。結(jié)合以上研究背景,本實(shí)驗(yàn)利用SD大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)模型,觀察持續(xù)電針預(yù)處理后缺血區(qū)腦組織炎癥反應(yīng)—MMP9表達(dá)—TJP完整性—BBB通透性等一系列變化并初步探索其內(nèi)在機(jī)制,希望能夠?qū)﹄娽橆A(yù)處理誘導(dǎo)缺血耐受的機(jī)制有更深刻的認(rèn)識(shí),為針對(duì)MMP9治療腦中風(fēng)帶來新的視角與契機(jī)。實(shí)驗(yàn)一、持續(xù)電針預(yù)處理對(duì)腦缺血再灌注損傷和BBB通透性的影響目的:驗(yàn)證持續(xù)電針預(yù)處理對(duì)腦缺血損傷的保護(hù)作用;觀察預(yù)處理及缺血后BBB通透性和腦水含量變化情況。方法:①持續(xù)電針預(yù)處理的神經(jīng)保護(hù)作用健康雄性SD大鼠32只,隨機(jī)分4組:假手術(shù)組(Sham,n=8)、單純電針預(yù)處理組(EA,n=8)、單純?nèi)毖俟嘧⒔M(MCAO,n=8)及電針預(yù)處理復(fù)合缺血再灌注組(EA+MCAO,n=8)。MCAO組及EA+MCAO組大鼠行MCAO后2h恢復(fù)再灌注,于再灌注后48h進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分并處死取腦行TTC染色檢測(cè)梗死容積。②電針預(yù)處理對(duì)腦缺血再灌后BBB通透性的影響健康雄性SD大鼠96只,隨機(jī)分4組:Sham組(n=24)、EA組(n=24)、MCAO組(n=24)及EA+MCAO組(n=24)。再將每組隨機(jī)分為4個(gè)批次,電針預(yù)處理5天、缺血2小時(shí)、再灌注48小時(shí)候后按不同要求取材。分別檢測(cè)各組動(dòng)物伊文斯藍(lán)(Evans Blue,EB)在腦實(shí)質(zhì)中的擴(kuò)散、EB滲透率和腦水含量。其中EB于再灌注后的第46小時(shí)經(jīng)尾靜脈注入。結(jié)果:①持續(xù)電針預(yù)處理具有誘導(dǎo)腦缺血耐受的作用。與MCAO組相比,EA+MCAO組動(dòng)物腦梗死容積減少,神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分有所改善(Ρ0.05);②電針預(yù)處理減輕了BBB破壞,降低了腦水腫程度。相較于MCAO組,EA+MCAO組動(dòng)物梗死側(cè)腦組織內(nèi)EB透過則明顯減少(Ρ0.05),同時(shí)EA+MCAO組大鼠梗死側(cè)腦內(nèi)腦水含量較MCAO組顯著降低(Ρ0.05)。結(jié)論:電針預(yù)處理能夠誘導(dǎo)腦缺血耐受,這一作用的發(fā)揮與其保持缺血損傷后BBB完整性關(guān)系密切。實(shí)驗(yàn)二、電針預(yù)處理對(duì)腦缺血再灌注后MMP9表達(dá)和活性的影響目的:證實(shí)電針預(yù)處理能夠通過降低缺血再灌后腦內(nèi)MMP9的表達(dá)水平和活性發(fā)揮腦保護(hù)作用。方法:健康雄性SD大鼠72只,隨機(jī)分為4組(n=18):Sham組、EA組、MCAO組及EA+MCAO組。于再灌注48h處死,按實(shí)驗(yàn)要求取梗死側(cè)及對(duì)側(cè)腦組織,使用免疫組織化學(xué)、免疫蛋白印記及明膠酶譜技術(shù)檢測(cè)各組大鼠腦組織內(nèi)MMP9的活性及表達(dá)情況。為了排除假陽性,在免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)中另設(shè)陰性對(duì)照組(Ab-)。結(jié)果:免疫組織化學(xué)、免疫蛋白印記及明膠酶譜試驗(yàn)均表明相較于MCAO組,EA+MCAO組大鼠在半暗帶的皮層及紋狀體區(qū)域MMP9的表達(dá)明顯減少(Ρ0.05),活性明顯降低(Ρ0.05)。而各組動(dòng)物非梗死側(cè)腦組織內(nèi)MMP9含量及活性無明顯差異。結(jié)論:持續(xù)電針預(yù)處理能夠降低缺血再灌注后腦組織內(nèi)MMP9的水平及活性。實(shí)驗(yàn)三、電針預(yù)處理對(duì)腦缺血再灌后血腦屏障TJP的影響目的:對(duì)血腦屏障TJP水平檢測(cè),證實(shí)電針預(yù)處理能夠通過降低缺血后MMP9的表達(dá)使TJP水解程度減輕,發(fā)揮腦保護(hù)效應(yīng)。方法:健康雄性SD大鼠30只,隨機(jī)分為5組(n=6):Sham組、EA組、MCAO組、EA+MCAO組及MMP9抑制劑復(fù)合缺血再灌注組(BB1101+MCAO)。根據(jù)分組進(jìn)行不同處理,其中BB1101+MCAO組于MCAO模型制作前30min腹腔注射BB1101(30mg/kg),再灌注48h后麻醉處死取半暗帶組織。使用Western blot分別檢測(cè)各組動(dòng)物腦內(nèi)三種緊密連接蛋白(Occludin、Claudin-5、ZO-1)的表達(dá)情況。結(jié)果:對(duì)三種緊密連接蛋白(Claudin-5、Occludin、ZO-1)分別檢測(cè)后發(fā)現(xiàn),與Sham組相比,MCAO組大鼠缺血半暗帶的皮層及紋狀體區(qū)三種蛋白表達(dá)明顯下降(P0.05);而與MCAO組相比,EA+MCAO組大鼠梗死側(cè)大腦皮層及紋狀體區(qū)的TJP水平則出現(xiàn)了顯著升高(P0.05);EA+MCAO組與BB-1101+MCAO組大鼠梗死側(cè)腦內(nèi)三種蛋白表達(dá)在皮層與紋狀體區(qū)沒有明顯差異性,同時(shí)各組大鼠非梗死側(cè)腦組織均未檢測(cè)到這三種蛋白的明顯變化。結(jié)論:電針預(yù)處理通過抑制腦缺血后MMP9的上調(diào),減輕了TJP水解,發(fā)揮腦保護(hù)效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)四、電針預(yù)處理對(duì)缺血半暗帶區(qū)炎癥水平及NF-κB活性的影響目的:前三部分實(shí)驗(yàn)表明電針預(yù)處理能夠通過抑制MMP9表達(dá)與活化,減輕TJP水解誘導(dǎo)腦缺血耐受,但其具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)從檢測(cè)電針預(yù)處理后腦缺血組織中的炎癥水平及NF-κB核轉(zhuǎn)位情況入手,探索電針預(yù)處理如何誘導(dǎo)缺血耐受,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。方法:健康雄性SD大鼠36只,隨機(jī)分為4組:Sham組(n=6)、EA組(n=6)、MCAO組(n=12)及EA+MCAO組(n=12)。再將MCAO組及EA+MCAO組隨機(jī)等分為兩個(gè)批次,其中第一批次按分組進(jìn)行電針預(yù)處理5d、缺血2h、再灌注48h后取材,使用ELISA法檢測(cè)炎癥因子(IL-1β、IL-10)及髓過氧化物酶(MPO)水平。另一批次與Sham及EA組合并,按分組要求預(yù)處理并在缺血2h、再灌注48h后取材,進(jìn)行核-漿蛋白分離抽提后分別檢測(cè)其NF-κB亞基p65的核轉(zhuǎn)位情況。結(jié)果:①運(yùn)用ELISA的方法檢測(cè)不同分組大鼠腦組織中炎癥因子表達(dá)水平及活性情況發(fā)現(xiàn),與MCAO組相比,EA+MCAO組大鼠梗死側(cè)腦組織皮層和紋狀體的IL-1β水平明顯降低(P0.05)而IL-10水平則大幅升高(P0.05),同時(shí)MPO活性顯著降低(P0.05)。但兩組大鼠非梗死側(cè)腦組織內(nèi)IL-1β、IL-10水平及MPO活性無明顯差異。②通過核-漿蛋白分離提取和Western blot對(duì)大鼠梗死側(cè)腦組織不同腦區(qū)的核蛋白及漿蛋白進(jìn)行檢測(cè)。其中核蛋白檢測(cè)結(jié)果顯示,與Sham組相比,MCAO組大鼠缺血半暗帶的皮層及紋狀體區(qū)NF-κB亞基p65水平明顯增高(P0.05);與MCAO組相比,EA+MCAO組大鼠梗死側(cè)腦組織皮層及紋狀體區(qū)p65明顯降低(P0.05);漿蛋白檢測(cè)結(jié)果則顯示,與Sham組相比,MCAO組大鼠缺血半暗帶的皮層及紋狀體區(qū)p65水平明顯降低(P0.05);與MCAO組相比,EA+MCAO組大鼠梗死側(cè)腦組織皮層及紋狀體區(qū)p65水平則有所升高(P0.05)。結(jié)論:電針預(yù)處理通過抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位減輕局部炎癥反應(yīng)而發(fā)揮腦保護(hù)作用�？偨Y(jié)本研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)電針預(yù)處理能夠通過抑制MMP9的上調(diào)與活化,從而減輕TJP的降解,維持BBB完整性,誘導(dǎo)腦缺血耐受作用。另外還初步證明電針預(yù)處理的腦保護(hù)機(jī)制與其抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位減輕局部炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。這提示電針預(yù)處理可成為臨床減輕局部炎癥反應(yīng),治療缺血性腦卒中的手段。
【關(guān)鍵詞】：腦缺血再灌注損傷 電針預(yù)處理 腦缺血耐受 基質(zhì)金屬蛋白酶-9 血腦屏障 緊密連接蛋白 炎癥因子 NF-κB
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R245
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 中文摘要6-11
• 英文摘要11-16
• 前言16-18
• 文獻(xiàn)回顧18-33
• 實(shí)驗(yàn)一 持續(xù)電針預(yù)處理對(duì)腦缺血再灌注損傷和BBB通透性的影響33-46
• 1 材料33-35
• 2 方法35-42
• 3 結(jié)果42-44
• 4 討論44-46
• 實(shí)驗(yàn)二 電針預(yù)處理對(duì)腦缺血后MMP9表達(dá)和活性的影響46-57
• 1 材料46-48
• 2 方法48-53
• 3 結(jié)果53-55
• 4 討論55-57
• 實(shí)驗(yàn)三 電針預(yù)處理對(duì)腦缺血后血腦屏障TJP的影響57-64
• 1 材料57-58
• 2 方法58-59
• 3 結(jié)果59-63
• 4 討論63-64
• 實(shí)驗(yàn)四 電針預(yù)處理對(duì)缺血半暗帶區(qū)炎癥水平及NF-κB活性的影響64-72
• 1 材料64-65
• 2 方法65-67
• 3 結(jié)果67-70
• 4 討論70-72
• 小結(jié)72-73
• 參考文獻(xiàn)73-87
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果87-88
• 致謝88

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 張鶴;嵇波;汪德生;宋艷;許詠思;張平;劉亞利;趙百孝;;電針對(duì)模擬失重大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)及能量代謝的影響[J];針刺研究;2014年06期

  本文關(guān)鍵詞：電針預(yù)處理通過MMP9調(diào)節(jié)TJP誘導(dǎo)大鼠腦缺血耐受的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：300672