本文關(guān)鍵詞：GCPⅡ基因剔除對(duì)顱腦外傷后神經(jīng)元的保護(hù)作用以及對(duì)外傷性腦水腫的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景腦外傷是神經(jīng)系統(tǒng)疾病中最常見的損傷,對(duì)人類的生命有著嚴(yán)重的威脅,其致殘率、患病率和死亡率居高不下,并且每年都有上升的趨勢(shì)。我國人口基數(shù)大人口增長(zhǎng)快,無論患病還是發(fā)病數(shù)量都是驚人。早前報(bào)道全球每年有近1000萬人發(fā)生腦外傷,其中有580萬人因腦外傷而死亡,占到世界死亡人口的10%,根據(jù)預(yù)測(cè)到2020年腦外傷將成為全球第三大類疾病。我國在研究腦外傷方面,主要側(cè)重在臨床方面,如腦外傷的救治、預(yù)后以及康復(fù)等方面,涉及到顱腦外傷的急救,各種治療方式的優(yōu)缺點(diǎn),治療后的認(rèn)知功能障礙護(hù)理、后遺癥等等,然而對(duì)腦外傷的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制的研究相對(duì)較少。腦外傷引起的神經(jīng)損傷主要為直接損傷和繼發(fā)性的間接腦損傷,直接或間接引起的神經(jīng)元的凋亡以及外傷后腦水腫引起的繼發(fā)性損害。大腦是動(dòng)物和人類的一個(gè)重要的組織器官,大腦皮層包括大量的神經(jīng)元,是控制行動(dòng)、語言、思維活動(dòng)的重要區(qū)域�？茖W(xué)家在人類和動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),腦外傷后大腦皮層的損傷,可以引起嚴(yán)重的行為、語言、思維活動(dòng)的損害,嚴(yán)重的影響了患者的病情和預(yù)后,目前尚缺乏有效的治療和保護(hù)措施,尤其是內(nèi)源性的保護(hù)機(jī)制。因此對(duì)腦外傷后大腦的保護(hù)機(jī)制以及措施的研究成為國際和國內(nèi)近幾年研究的熱門話題。顱腦損傷后,遭受打擊的神經(jīng)細(xì)胞會(huì)釋放以谷氨酸為主的興奮型神經(jīng)遞質(zhì),激活谷氨酸受體并且直接或者間接的啟動(dòng)電壓依賴性Ca2+通道,Ca2+的大量?jī)?nèi)流使細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載。Ca2+與鈣離子調(diào)節(jié)蛋白相結(jié)合,進(jìn)一步的反應(yīng)作用而使得皮層神經(jīng)元受到損害。另一方面,產(chǎn)生大量超氧陰離子產(chǎn)生,進(jìn)一步反應(yīng)生成過氧化亞硝酸鹽離子或亞硝酸根離子,進(jìn)而進(jìn)一步抑制能量代謝。能量代謝的抑制使細(xì)胞內(nèi)膜損傷和自由基增加,致使細(xì)胞內(nèi)線粒體腫脹等多種因素引起細(xì)胞的凋亡。近年來我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)在腦外傷腦損傷后釋放大量谷氨酸的同時(shí)也釋放著一種具有神經(jīng)保護(hù)作用的肽類神經(jīng)遞質(zhì)N-乙酰天冬氨酸谷氨酸(N-acetylaspartylglutamate,NAAG),NAAG對(duì)外傷后谷氨酸的釋放具有極強(qiáng)的抑制作用。NAAG肽酶位于膠質(zhì)細(xì)胞上,然而NAAG釋放后很快被NAAG肽酶水解成N-乙酰天冬氨酸(N-acetylaspartate,NAA)及谷氨酸,因此而失去了神經(jīng)保護(hù)作用。由此NAAG肽酶的活性被抑制,從而抑制NAAG的降解,提高突觸間隙NAAG的濃度,進(jìn)而減少谷氨酸釋放在病理進(jìn)程中的進(jìn)一步損害。NAAG肽酶抑制劑在大量的試驗(yàn)中被成功合成并在谷氨酸過度釋放的谷氨酸毒性模型中進(jìn)一步證實(shí)了其保護(hù)作用,然抑制劑易受環(huán)境以及自身藥物濃度等方面的影響而影響其發(fā)揮作用的穩(wěn)定度,NAAG肽酶基因剔除后能更穩(wěn)定的消除NAAG肽酶的表達(dá)從而起到神經(jīng)保護(hù)作用,目前在基因?qū)用娴难芯磕壳磅r為少見。在本試驗(yàn)中,應(yīng)用控制性腦皮質(zhì)撞擊儀,對(duì)前期成功建立起來的GCPⅡ基因剔除模型小鼠進(jìn)行打擊制作中度顱腦損傷模型的研究,通過一系列檢測(cè)指標(biāo),觀察大腦皮層損傷以及繼發(fā)性變化,從而進(jìn)一步認(rèn)證GCPⅡ基因剔除對(duì)小鼠腦外傷后腦組織的保護(hù)作用。第一部分小鼠GCPⅡ基因剔除對(duì)腦外傷后神經(jīng)元的影響的研究目的通過對(duì)小鼠中度顱腦損傷模型的建立,對(duì)小鼠大腦損傷周圍區(qū)神經(jīng)元的凋亡情況進(jìn)行研究,探討GCPⅡ基因剔除對(duì)腦外傷后神經(jīng)元的影響。方法雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)20只,隨機(jī)分成兩組(C57BL/6J小鼠假手術(shù)組10只,C57BL/6J小鼠顱腦損傷組10只);雄性GCPⅡ基因剔除小鼠20只,隨機(jī)分成兩組(GCPⅡ基因剔除小鼠假手術(shù)10只,GCPⅡ基因剔除小鼠顱腦損傷組10只)(均為8-12W,體重20-25g,均由上海南方模式生物研究中心提供)。取0.6%戊巴比妥溶液,80mg/kg對(duì)小鼠行腹腔注射麻醉;將小鼠固定于腦立體定向儀(Stoeling Inc.USA);并在人字縫和矢狀縫的交界處消毒。作正中切口,鑷子分開頭皮并用骨膜剝離子剝離骨膜;電鉆在人字縫之間和右側(cè)冠狀縫、中線旁3mm處進(jìn)行顱骨鉆孔,做出直徑為3mm的骨窗并暴露完整硬腦膜;應(yīng)用Pin PointTMPCI3000精細(xì)顱骨撞擊儀(Hatteras Instruments Inc.USA)設(shè)定打擊參數(shù)(打擊深度1.0mm;打擊時(shí)間均為80ms;打擊速度均為1.5m/s),以直徑3mm的打擊頭行精確撞擊小鼠腦皮質(zhì)。還回骨瓣,頭皮進(jìn)行縫合。假手術(shù)組在麻醉后暴露骨窗,對(duì)腦皮質(zhì)不打擊,還納骨瓣并縫合頭皮。傷后24h對(duì)小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分,斷頭、取腦、切片后行免疫熒光染色,通過對(duì)損傷周圍區(qū)域凋亡神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù),觀察不同組別神經(jīng)元凋亡的變化。結(jié)果神經(jīng)功能評(píng)分的結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示腦外傷后GCPⅡ基因剔除小鼠在神經(jīng)功能綜合評(píng)分方面相對(duì)C57BL/6J小鼠明顯的改善和提高,外傷后GCPⅡ基因剔除小鼠與C57BL/6J小鼠神經(jīng)功能評(píng)分差距有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),GCPⅡ基因剔除小鼠較C57BL/6J小鼠外傷后神經(jīng)元凋亡數(shù)量明顯減少,兩組數(shù)值差距具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論通過研究我們發(fā)現(xiàn)小鼠GCPⅡ基因敲除后,腦組織損傷周圍區(qū)域神經(jīng)元凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯減少,小鼠神經(jīng)功能明顯改善。第二部分小鼠的GCPⅡ基因剔除對(duì)腦外傷后腦水腫的影響的研究目的研究普通小鼠和GCPⅡ基因剔除后小鼠腦外傷后腦水腫以及神經(jīng)功能的變化,探討并研究GCPⅡ基因剔除后對(duì)腦外傷后腦水腫的影響。方法雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)20只,隨機(jī)分成兩組(C57BL/6J小鼠假手術(shù)組10只,C57BL/6J小鼠顱腦損傷組10只);雄性GCPⅡ基因剔除小鼠20只,隨機(jī)分成兩組(GCPⅡ基因剔除小鼠假手術(shù)10只,GCPⅡ基因剔除小鼠顱腦損傷組10只)(均為8-12W,體重20-25g,均由上海南方模式生物研究中心提供)。應(yīng)用Pin PointTMPCI3000精細(xì)顱腦撞擊儀,設(shè)定參數(shù)(打擊深度為1.0mm;打擊時(shí)間為80ms,打擊的速度為1.5m/s),精確撞擊小鼠腦皮質(zhì)。小鼠顱腦外傷后24h,進(jìn)行干濕重比較法測(cè)定腦組織含水量,MRI掃描并測(cè)量計(jì)算損傷區(qū)域水腫體積以及T2WI序列的信號(hào)強(qiáng)度,行大腦外傷周圍區(qū)域免疫熒光染色,檢測(cè)Western Blot檢測(cè)AQP4蛋白的表達(dá),檢測(cè)血腦屏障破壞程度。結(jié)果GCPⅡ基因剔除小鼠較C57BL/6J小鼠外傷后神經(jīng)功能明顯善(p0.05);GCPⅡ基因剔除小鼠腦組織含水量、水腫體積以及外傷區(qū)域T2WI信號(hào)強(qiáng)度較C57BL/6J小鼠組降低(p0.05);GCPⅡ基因剔除小鼠明顯減少損傷側(cè)伊文思藍(lán)含量(p0.05);GCPⅡ基因剔除小鼠免疫熒光檢測(cè)到腦組織損傷區(qū)域周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4蛋白含量明顯下降;Western Blot檢測(cè)AQP4蛋白的表達(dá)明顯下降(p0.05)。結(jié)論小鼠的GCPⅡ基因剔除后腦外傷后腦水腫較C57BL/6J小鼠明顯減輕,神經(jīng)功能明顯改善,進(jìn)一步證明小鼠GCPⅡ基因敲除后對(duì)腦外傷后腦組織的保護(hù)作用。
【關(guān)鍵詞】：顱腦損傷 GCPⅡ 免疫熒光染色 神經(jīng)功能評(píng)分 基因剔除 神經(jīng)元 凋亡 顱腦損傷 GCPⅡ 基因剔除 AQP4 腦水腫 磁共振成像 免疫熒光 Western Blot檢測(cè) 血腦屏障
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R651.15
【目錄】：

• 摘要5-9
• ABSTRACT9-15
• 符號(hào)說明15-16
• 前言16-20
• 第一部分 小鼠GCPⅡ基因剔除對(duì)腦外傷后神經(jīng)元的影響的研究20-38
• 1.1 引言20-21
• 1.2 材料和方法21-32
• 1.3 結(jié)果32-35
• 1.4 討論35-38
• 第二部分 小鼠的GCPⅡ基因剔除對(duì)腦外傷后腦水腫的影響的研究38-64
• 2.1 引言38
• 2.2 材料和方法38-55
• 2.3 結(jié)果55-62
• 2.4 討論62-64
• 總結(jié)64-65
• 全文討論65-71
• 參考文獻(xiàn)71-84
• 攻讀學(xué)位期間學(xué)術(shù)論文84-85
• 致謝85-86

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