研究背景與目的:全身麻醉的開展距今已有160多年的歷史,關(guān)于全麻機(jī)制的解釋爭論較多,近年來神經(jīng)科學(xué)家認(rèn)為:作用在大腦不同腦區(qū)、核團(tuán)的全麻藥物,通過特定的作用靶點調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)水平,形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)相互作用,使機(jī)體在麻醉-覺醒狀態(tài)間進(jìn)行轉(zhuǎn)換。2016年P(guān)NAS雜志報道:在異氟醚麻醉下,利用光遺傳技術(shù)激活小鼠中腦腹側(cè)被蓋區(qū)(ventral tegmental area,VTA)的多巴胺能神經(jīng)元能夠使其立即覺醒,VTA核團(tuán)多巴胺能神經(jīng)元接收來自腹外側(cè)視前區(qū)(ventrolateral proptic nucleus,VLPO),和中縫背核(dorsal raphe nucleu DR)等核團(tuán)神經(jīng)纖維的投射,也能夠?qū)⑸窠?jīng)纖維投射到前額皮質(zhì)區(qū)(prefrontal cortex,PFC)和伏隔核(nucleus accumbens,NAc)等核團(tuán)。那么 VTA核團(tuán)多巴胺能神經(jīng)元是如何受到其它神經(jīng)核團(tuán)投射調(diào)節(jié)?又是通過對哪些核團(tuán)進(jìn)行調(diào)節(jié)從而介導(dǎo)麻醉與覺醒之間的轉(zhuǎn)換,目前尚不清楚�；谝陨峡茖W(xué)問題,本研究將利用free-moving動物模型、腦內(nèi)核團(tuán)微注射、神經(jīng)電生理以及化學(xué)遺傳學(xué)等技術(shù)方法,研究在七氟醚麻醉藥物誘導(dǎo)以及向覺醒轉(zhuǎn)換過程中,神經(jīng)環(huán)路中VTA核團(tuán)多巴胺能神經(jīng)元的作用,探討VTA-mPFC通路多巴胺能神經(jīng)元在七氟醚麻醉-覺醒中的調(diào)節(jié)作用,初步探討其作用機(jī)制。第一部分目的:通過系統(tǒng)性給藥、核團(tuán)微注射和DREADD技術(shù)等方法研究VTA核團(tuán)多巴胺能神經(jīng)元在七氟醚麻醉-覺醒調(diào)控中的作用及機(jī)制。方法:實驗動物:雄性SD大鼠,體重250～280g。1 系統(tǒng)性證實多巴胺能神經(jīng)元是否參與七氟醚麻醉-覺醒過程的調(diào)控。18只SD大鼠隨機(jī)分為3組(n=6):CON組、SCH組、APB組。在實驗環(huán)境適應(yīng)5d后進(jìn)行行為學(xué)實驗,所用藥物均稀釋到0.5ml。CON組:腹腔注射生理鹽水;SCH組:腹腔注射D1受體拮抗劑SCH23390(2mg/kg);APB組:腹腔注射D1受體激動劑Chloro-APB(3mg/kg)。觀察藥物對大鼠七氟醚麻醉誘導(dǎo)及覺醒時間的影響,麻醉誘導(dǎo)觀察指標(biāo)為翻正反射消失時間,麻醉覺醒觀察指標(biāo)為翻正反射恢復(fù)時間。2 藥理學(xué)方法證實VTA核團(tuán)對七氟醚麻醉-覺醒的調(diào)控作用。60只SD大鼠隨機(jī)分為5組(n=12):CON組、MK-801 組、SCH組、Bicu(Bicuculline)組、DMSO組。實驗前進(jìn)行VTA核團(tuán)微注射導(dǎo)管埋置和腦電電極植入,恢復(fù)5d后每組隨機(jī)抽取6只大鼠VTA核團(tuán)注射相應(yīng)藥物0.3μL。CON組:注射生理鹽水;SCH組:注射D1受體拮抗劑SCH23390(5mg/ml);Bicu組:注射GABAA受體拮抗劑Bicuculline(2.5mg/ml);MK-801 組:注射NMDA受體拮抗劑MK-801(0.6mg/ml);DMSO組:作為Bicu組的對照組(DMSO為Bicuculline的有機(jī)溶劑)。注藥15min后開始麻醉觀察藥物對七氟醚麻醉誘導(dǎo)時間的影響。每組其余6只大鼠,則于麻醉開始后15min注藥,觀察藥物對麻醉覺醒時間的影響。3 采用DREADD技術(shù)證實特異性激活VTA核團(tuán)多巴胺能神經(jīng)元對七氟醚麻醉-覺醒的影響。12只大鼠隨機(jī)分為2組(n=6):hM3Dq組和CON組。hM3Dq組:VTA核團(tuán)注射含hM3Dq的重組腺相關(guān)病毒(rAAV-DIO-hM3Dq-mCherry);CON組:VTA核團(tuán)注射不帶有hM3Dq但其它病毒元件與實驗組一致的“空病毒”(rAAV-DIO-mCherry)作為對照�；謴�(fù)28d后,兩組動物均給予腹腔注射CNO,觀察特異性激活VTA核團(tuán)多巴胺能神經(jīng)元后對大鼠麻醉誘導(dǎo)與覺醒時間的影響。結(jié)果:1 大鼠腹腔注射D1受體拮抗劑SCH23390后與CON組比七氟醚麻醉誘導(dǎo)時間明顯縮短(P0.01),覺醒時間明顯延長(P0.01);腹腔注射D1受體激動劑Chloro-APB后與CON組比七氟醚麻醉誘導(dǎo)時間明顯延長(P0.01),覺醒時間明顯縮短(P0.05)。2 大鼠VTA核團(tuán)給予NMDA受體拮抗劑MK-801后與CON組比麻醉誘導(dǎo)時間明顯縮短(P0.01),覺醒時間明顯延長(P0.01);VTA核團(tuán)給予D1受體拮抗劑SCH23390后與CON組比麻醉誘導(dǎo)時間明顯縮短(P0.01),覺醒時間明顯延長(P0.01);VTA核團(tuán)給予DMSO后與CON組比七氟醚麻醉誘導(dǎo)時間及覺醒時間無明顯差異(P0.05);VTA核團(tuán)給予GABAA受體拮抗劑Bicuculline與DMSO組比麻醉誘導(dǎo)時間明顯延長(P0.05),覺醒時間明顯縮短(P0.05)。3 大鼠經(jīng)過核團(tuán)微注射病毒及腹腔注射CNO,特異性激活VTA核團(tuán)多巴胺能神經(jīng)元后,hM3Dq組與CON組相比七氟醚麻醉誘導(dǎo)時間延長(P0.05),覺醒時間顯著縮短(P0.01)。第二部分目的:通過核團(tuán)微注射和DREADD技術(shù)研究VTA-mPFC通路在七氟醚麻醉-覺醒調(diào)控中的作用及機(jī)制。方法:實驗動物:雄性SD大鼠,體重250～280g。1 藥理學(xué)方法證實mPFC區(qū)多巴胺能神經(jīng)元對七氟醚麻醉-覺醒的調(diào)控作用。36只大鼠隨機(jī)分為3組(n=12):CON組、SCH組、APB組。實驗前進(jìn)行微注射導(dǎo)管埋置,恢復(fù)5d后每組隨機(jī)抽取6只大鼠,mPFC區(qū)微注射藥物0.5μL,CON組:注射生理鹽水;SCH組:注射D1受體拮抗劑SCH23390(5mg/ml);APB組:注射D1受體激動劑Chloro-APB(6mg/ml)。注藥15min后開始麻醉,觀察藥物對七氟醚麻醉誘導(dǎo)時間的影響。每組其余6只大鼠,則于麻醉開始后15min注藥,觀察藥物對麻醉覺醒時間的影響。2 藥理學(xué)方法證實VTA-mPFC通路對七氟醚麻醉-覺醒的調(diào)節(jié)作用。48只大鼠隨機(jī)分4組(n=12):CON組、VTA-Bicu(Bicuculline)組、mPFC-SCH組、Bicu/SCH組。實驗前進(jìn)行微注射導(dǎo)管埋置,恢復(fù)5d后每組隨機(jī)抽取6只大鼠VTA核團(tuán)與mPFC區(qū)注射相應(yīng)藥物,藥物濃度分別為Bicuculline(2.5mg/ml)、SCH23390(5mg/ml)。CON組:VTA核團(tuán)注射Bicuculline的有機(jī)溶劑DMSO 0.3μL,mPFC區(qū)注射0.5μL生理鹽水;VTA-Bicu組:VTA核團(tuán)注射GABAA受體拮抗劑Bicuculline 0.3μL,mPFC區(qū)注射生理鹽水0.5μL;mPFC-SCH組:VTA核團(tuán)注射DMSO 0.3μL,mPFC區(qū)注射D1受體拮抗劑 SCH23390 0.5μL;Bicu/SCH組:VTA核團(tuán)注射Bicuculline 0.3μL,mPFC區(qū)注射SCH23390 0.5μL。注藥15min后開始麻醉,觀察各種藥物對七氟醚麻醉誘導(dǎo)時間的影響。每組其余6只大鼠,則于麻醉開始后15min注藥,觀察藥物對麻醉覺醒時間的影響。3 DREADD技術(shù)證實VTA-mPFC通路多巴胺能神經(jīng)元對七氟醚麻醉-覺醒的主要作用。12只大鼠隨機(jī)分為2組(n=6):hM3Dq組和CON組。hM3Dq組:VTA核團(tuán)注射含hM3Dq的重組腺相關(guān)病毒(rAAV-DIO-hM3Dq-mCherry);CON組:VTA核團(tuán)注射不帶有hM3Dq但其它病毒元件與實驗組一致的“空病毒”(rAAV-DIO-mCherry)作為對照組�；謴�(fù)28d后,兩組動物均在mPFC區(qū)注射CNO,觀察VTA-mPFC通路多巴胺能神經(jīng)元激活后對大鼠的麻醉誘導(dǎo)與覺醒時間的影響。結(jié)果:1 nPFC區(qū)注射D1受體拮抗劑SCH23390后與CON組比七氟醚麻醉誘導(dǎo)時間顯著縮短(P0.01),麻醉覺醒時間顯著延長(P0.01);mPFC區(qū)注射D1受體激動劑Chloro-APB后與CON組比七氟醚麻醉誘導(dǎo)時間顯著延長(P0.01),覺醒時間顯著縮短(P0.01)。2 VTA核團(tuán)注射Bicuculline后與CON組比七氟醚麻醉誘導(dǎo)時間延長,麻醉覺醒時間縮短(P0.01);mPFC區(qū)注射SCH23390后與CON組比七氟醚麻醉誘導(dǎo)時間縮短,麻醉覺醒時間延長(P0.01);而VTA核團(tuán)注射Bicuculline同時mPFC區(qū)注射SCH23390與CON組比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3 hM3Dq組與CON相比,特異性激活VTA-mPFC通路多巴胺能神經(jīng)元后,七氟醚麻醉誘導(dǎo)時間顯著延長(P0.01),麻醉覺醒時間顯著縮短(P0.01)。結(jié)論:本研究證實了VTA核團(tuán)多巴胺能神經(jīng)元及其受體活性變化可以對七氟醚麻醉-覺醒產(chǎn)生影響,這些結(jié)果提示VTA核團(tuán)多巴胺能神經(jīng)元在全麻作用機(jī)制的神經(jīng)網(wǎng)路中發(fā)揮重要作用,并且VTA-mPFC通路多巴胺能神經(jīng)元在麻醉-覺醒的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R614
【部分圖文】：

白質(zhì)學(xué)說”此前他們的研究證實，麻醉藥物可以與細(xì)胞膜上的特定受體、通道蛋白等逡逑相互作用，認(rèn)為全麻藥物是作用于特定離子通道或蛋白質(zhì)發(fā)揮作用［３］。但是，近年來逡逑神經(jīng)科學(xué)家認(rèn)為：在大腦不同腦區(qū)、核團(tuán)的全麻藥物，通過特定的作用靶點調(diào)節(jié)神經(jīng)逡逑遞質(zhì)水平，形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)相互作用，使機(jī)體在麻醉－覺醒狀態(tài)間進(jìn)行轉(zhuǎn)換。麻藥物引逡逑起的可逆性意識消失與恢復(fù)（Ｒｅｃｏｖｅｒｙ邋ｏｆ邋ｃｏｎｓｃｉｏｕｓｎｅｓｓ，邋ＲＯＣ）的全麻機(jī)制研究有助于逡逑信號處理和人類認(rèn)知功能的研究［４］。異氟醚、七氟醚［５，６］等吸入麻醉劑和靜脈麻醉藥丙逡逑泊酚［７］通過網(wǎng)狀上行激活系統(tǒng)相關(guān)的丘腦、中腦等結(jié)構(gòu)區(qū)域，最終作用于大腦皮質(zhì)產(chǎn)逡逑生抑制作用，發(fā)揮麻醉效應(yīng)。在這些神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中，一些重要的核團(tuán)和腦區(qū)，如中縫背逡逑核（ｄｏｒｓａｌ邋ｒａｐｈｅ邋ｎｕｃｌｅｕｓ，邋ＤＲ）｜８］，腹外側(cè)視前區(qū)（Ｖｅｎｔｒｏｌａｔｅｒａｌ邋ｐｒｅｏｐｔｉｃ邋ｎｕｃｌｅｕｓ，邋ＶＬＰＯ）［９］，逡逑穹隆周（ｐｅｒｉｆｏｍｉｃａｌ，Ｐｅｆ）［１Ｑ］等網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中的關(guān)鍵核團(tuán)，參與麻醉－覺醒調(diào)控（圖１）為逡逑全麻藥物作用機(jī)制的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控學(xué)說提供了強(qiáng)有力的證據(jù)。這些相互關(guān)聯(lián)的核團(tuán)通逡逑過神經(jīng)纖維投射，形成了多個相互調(diào)控相互作用的神經(jīng)回路［３，１１］。逡逑

變導(dǎo)致大鼠應(yīng)激對實驗結(jié)果造成影響，麻醉圓筒進(jìn)氣端連接小動物放有堿石灰避免Ｃ0２重復(fù)吸入，出氣端連接廢氣回收裝置，麻醉圓筒恒溫毯，保持圓筒內(nèi)溫度在２４±０．５°Ｃ，吸入３０％氧氣，流量２Ｌ／ｍｉｎ。物，生理鹽水稀釋所用藥物用到0．５ｍｌ，邋Ｃｈｌｏｒｏ－ＡＰＢ置于超聲水浴箱ＯＮ組：注射生理鹽水０．５ｍｌ；邋ＳＣＨ組：注射ＳＣＨ２３３９０邋（２ｍｇ／ｋｇ）；邋ＡＰｌｏｒｏ－ＡＰＢ邋（３ｍｇ／ｋｇ）。注射藥物前進(jìn)行回吸，回吸無血后再進(jìn)行推注，１。逡逑七氟醚麻醉并計時，輸出濃度為２．４％。待大鼠意識消失后，每１５ｓ轉(zhuǎn)動鼠處于異常體位時不能主動恢復(fù)正常體位（即四肢著地位）并且１５ｓ翻正反射消失，此時間記為ＬＯＲＲ時間。逡逑第３０ｍｉｎ關(guān)閉揮發(fā)罐，停止七氟醚麻醉，觀察大鼠翻正反射是否恢復(fù)，位時，能主動恢復(fù)正常體位，認(rèn)為其翻正反射恢復(fù)，此時記為ＲＯＲＲ圖２。逡逑ＬＯＲＲ邐ＲＯＲＲ逡逑

逑單位青霉素肌肉注射預(yù)防感染，術(shù)后將大鼠單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水，恢復(fù)５ｄ后藥理學(xué)逡逑方法證實，ＶＴＡ核團(tuán)對七氟醚麻醉－覺醒的調(diào)控作用。微注射導(dǎo)管埋置流程如圖３。逡逑ｍｍ逡逑ｍ逡逑圖３：圖為大鼠埋置微注射導(dǎo)管流程。逡逑２．２．３藥理學(xué)方法證實ＶＴＡ核團(tuán)對七氟醚麻醉－覺醒調(diào)控作用的實驗方法逡逑１）

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