【摘要】：第一章：促滲劑二甲基亞砜在小鼠透皮實驗中的最適濃度研究 研究目的：檢測二甲基亞砜(dimethylsulfoxide, DMSO)的不同濃度是否影響報告基因pORF-LacZ透過小鼠皮膚的轉染效率以及探討DMSO在促進報告基因pORF-LacZ經皮滲透效率過程中的最適濃度,為二期實驗中應用最適濃度的DMSO制劑促進pORF-LacZ基因透過皮膚(皮瓣)作進一步研究奠定理論基礎。研究方法：選取8周齡清潔級健康雄性Balb/c小鼠(購買于南方醫(yī)科大學動物實驗中心)20只,體重20—-22g,實驗室環(huán)境：環(huán)境溫度為22.0±2.0℃,相對濕度55.6%±4%。按濃度不同隨機分為0%DMSO組,5%DMSO組,10%DMSO組,30%DMSO組4組,每組5只小鼠。DMSO配方的濃度主要以在總體積150μl中DMSO所占百分比為基礎,各配方中DMSO的濃度分別為30%(formula1),10%(formula2),5%(formula3),0%(formula4),每個配方中均含有150ug的報告基因pORF-LacZ質粒。按如下步驟操作：每只小鼠以1%戊巴比妥鈉溶液進行腹腔注射麻醉后固定,于小鼠背部中央設計一個蒂在頭側的模擬隨意型皮瓣(蒂寬1cm、長3cm),在轉染皮膚之前,脫毛膏背部脫毛,3-5min后,用0.9%氯化鈉溶液(生理鹽水)處理15min,隨后于小鼠背部皮瓣相應區(qū)域涂抹20u1含0.05%維甲酸(retinoic acid, RA)(維甲酸溶于0.9%氯化鈉溶液中)、20u1的濃度為1%Toll樣受體2(Toll like receptor2,TLR2)抑制劑--脂質羊毛硫氨酸肽(lipolanthionine peptides,LP)及DMSO混合制劑,這個過程每隔一天進行一次,連續(xù)1周。到第7天,當涂抹最后一次DMSO、LP和RA混合制劑4小時后,用移液器吸取10ul的混合物(150ug的pORF-LacZ和15u1的不同濃度DMSO溶于水中,總體積為150u1)均勻地涂抹于小鼠背部皮瓣上,這個過程進行3天,每天1次。第4天于皮瓣下部收集透過的質粒,樣本分成兩份,實時熒光定量PCR檢測pORF-lacz基因透過量。用水合氯醛麻醉實驗小鼠,然后進行處死,并收集它們的背部皮膚樣本。樣本先用PBS溶液處理,而后被固定在帶有一定擴散面積的擴散池中,此處包括有測定位點隔間和受體隔間,且兩種隔間分別被安裝在擴散池的兩側。皮膚表面朝向測定位點隔間的一側,受體隔間中充滿RPMI1640培養(yǎng)基,此實驗過程中,pEGFP-N1質粒(5ug)被加入到培養(yǎng)基中作為內參。已經準備好的基于不同濃度的DMSO等混合制劑被加到測定位點隔間。受體隔間中的培養(yǎng)基在整個實驗當中以45轉/min的轉速進行攪拌。整個裝置被置于37.0±0.5℃的環(huán)境條件下。 取樣后,背部皮膚在2%的甲醛和0.2%的戊二醛的混合液當中浸泡2-4小時,溶液的溫度保持在4℃的環(huán)境下,然后在室溫下先后用三種不同濃度的PBS(PH7.4)洗滌60min,接著所有的樣本在37.0℃的環(huán)境下被置于1mg/ml X-gal當中浸泡過夜。第2天,所有的樣本在室溫條件下先后用三種不同濃度的PBS(PH7.4)洗滌60min,接著在室溫條件下被放置于10%福爾馬林溶液當中浸泡24小時,然后用水沖洗過夜。 研究結果：在不同濃度DMSO混合制劑的作用下,報告基因pORF-lacz透皮表達量分別為(F=337.718)： a.當DMSO濃度為10%時,pORF-lacz基因透皮表達量最高(5.378±0.346μg/cm2), 顯著性高于另外三組,P=0.000,差異具有統(tǒng)計學意義； b. DMSO濃度為0時,pORF-lacz基因透皮表達量最低(0.940±0.095μg/cm2),顯著性低于另外三組,P=0.000,差異具有統(tǒng)計學意義； c.而DMSO濃度為5%和30%時,pORF-lacz基因透皮表達量居中(分別為2.376±0.190μg/cm2和2.516±0.199μg/cm2),兩者之間差異并無統(tǒng)計學意義。 結論：當DMSO濃度為10%時,報告基因pORF-lacz透皮表達量最高,可確定此為促進報告基因透過小鼠皮膚的最適使用濃度,因此在本課題進一步研究中,將選用濃度為10%的DMSO作為關鍵促滲劑。 第二章：RA和LP對小鼠皮膚claudin-4和ZO-1影響的實驗研究研究目的：探討經10%DMSO作為促滲劑,維甲酸(retinoic acid, RA)和Toll樣受體2(Toll like receptor2,TLR2)抑制劑--脂質羊毛硫氨酸肽(lipolanthionine peptides,LP)按照分組施加干預后,小鼠皮膚連接蛋白claudin-4和ZO蛋白-1(ZO-1)表達的改變情況和皮膚相應透過功能的變化規(guī)律。 研究方法：選取8周齡清潔級健康雄性Balb/c小鼠(購買于南方醫(yī)科大學動物實驗中心)30只,體重20-22g。實驗室環(huán)境：環(huán)境溫度為22.0±2.0℃,相對濕度55.6%±4%。將小鼠隨機分為5組：RA+LP+DMSO+pORF-LacZ; DMSO+pORF-LacZ; LP+DMSO+pORF-LacZ; RA+DMSO+pORF-LacZ;生理鹽水對照組,每組6只。 按如下步驟操作：選取8周齡小鼠背部一定面積(1cm×1cm)的皮膚,用脫毛膏脫出此選定皮膚區(qū)域的毛發(fā),3-5min后,用0.9%氯化鈉溶液處理,15mmin后,按照分組,小鼠背部皮膚分別被涂抹20u1含0.05%維甲酸(RA)(維甲酸溶于0.9%氯化鈉溶液中)+10%DMSO制劑和20u1的濃度為1%TLR2抑制劑LP+10%DMSO制劑,或者涂抹兩者的聯(lián)合制劑+10%DMSO制劑,或者10%DMSO制劑,這個過程每隔一天進行一次,連續(xù)1周,對照組作同樣處理。第7天,最后用上述相應制劑處理后,施用最適濃度10%DMSO配置的pORF-LacZ質粒,處理過程進行3天,每天1次,第4天處死小鼠,收集皮膚標本,然后運用皮膚免疫組化和western blot檢測緊密連接蛋白claudin-4和ZO蛋白-1(ZO-1)的表達情況。 背部皮膚在2%的甲醛和0.2%的戊二醛的混合液當中浸泡2-4小時,溶液的溫度保持在4℃C的環(huán)境下,然后在室溫下先后用三種不同濃度的PBS(PH7.4)洗滌60mmin,接著所有的樣本在37.0℃C的環(huán)境下被置于1mg/ml X-gal當中浸泡過夜。第2天,所有的樣本在室溫條件下先后用三種不同濃度的PBS(PH7.4)洗滌60mmin,接著在室溫條件下被放置于10%福爾馬林溶液當中浸泡24小時,然后用水沖洗過夜。 研究結果： 1.根據(jù)HE染色圖片所示：DMSO、RA和LP干預后的實驗組小鼠皮膚角質層細胞連接間隙增大,細胞連接疏松,生理鹽水對照組小鼠的皮膚并未出現(xiàn)上述現(xiàn)象；所有的實驗組小鼠皮膚并未出現(xiàn)病理性的破壞。在各實驗組中,DMSO組和RA+DMSO組小鼠皮膚略微出現(xiàn)了皮膚乳頭狀突起、皮膚水腫、中性粒細胞聚集和毛細管擴張等現(xiàn)象,與之相比,LP+DMSO組和RA+LP+DMSO組的小鼠皮膚水腫現(xiàn)象減少,毛細血管擴張現(xiàn)象有所緩解。 2.免疫組化實驗結果： (1)claudin-4的表達情況(F=16.174,P=0.000)： a.與鹽水對照組相比,RA+LP+DMSO+pORF-LacZ、LP+DMSO+pORF-LacZ兩組目的蛋白-claudin-4的表達量(分別為29.827±2.849、32.932±4.890)顯著低于前者的蛋白表達(42.830±3.865)(p0.01),差異具有顯著統(tǒng)計學意義； b.與RA+DMSO+pORF-LacZ相比,RA+LP+DMSO+pORF-LacZ目的蛋白-claudin-4的表達量(29.827±2.849)顯著低于前者的蛋白表達(39.388±2.053)(p0.01),差異具有顯著統(tǒng)計學意義； c.LP+DMSO+pORF-LacZ目的蛋白-claudin-4的表達量(32.932±4.890)低于RA+DMSO+pORF-LacZ組的蛋白表達(39.388±2.053)(p0.05),差異具有統(tǒng)計學意義； d.與DMSO+pORF-LacZ組相比,RA+LP+DMSO+pORF-LacZ LP+DMSO+pORF-LacZ兩組目的蛋白-claudin-4的表達量(分別為分別為29.827±2.849、32.932±4.890)顯著低于前者的蛋白表達(40.202±1.872)(p0.01),差異具有統(tǒng)計學意義。 (2)zo-1蛋白表達情況(F=97.827,P=0.000)：a.與鹽水對照組相比,RA+LP+DMSO+pORF-LacZ、LP+DMSO+pORF-LacZ、 RA+DMSO+pORF-LacZ、DMSO+pORF-LacZ四組目的蛋白—zo-1的表達量(分別為21.367±1.892、31.613±0.911、32.047±1.976、34.697±1.748)顯著低于鹽水對照組的蛋白表達量(41.473±2.174)(p0.01),差異具有顯著統(tǒng)計學意義；b.RA+LP+DMSO+pORF-LacZ目的蛋白——zo-1的表達量(21.367±1.892)顯著低于RA+DMSO+pORF-LacZ組的蛋白表達量(32.047±1.976)(p0.01),鹽水對照組目的蛋白表達量(41.473±2.174)顯著高于RA+DMSO+pORF-LacZ組的蛋白表達量(32.047±1.976)(p0.01),差異具有顯著統(tǒng)計學意義； c.DMSO+pORF-LacZ目的蛋白—-zo-1的表達量(34.697±1.748)高于RA+DMSO+pORF-LacZ組的蛋白表達(32.047±1.976)(p0.05),差異具有統(tǒng)計學意義； d.與DMSO+pORF-LacZ組相比,RA+LP+DMSO+pORF-LacZ、 LP+DMSO+pORF-LacZ組目的蛋白—zo-1的表達量(分別為21.367±1.892、31.613±0.911)顯著低于前者(34.697±1.748)(p0.01),差異具有顯著統(tǒng)計學意義。 e.RA+LP+DMSO+pORF-Lac組目的蛋白—zo-1的表達量顯著低于LP+DMSO+pORF-LacZ組表達量(分別為21.367±1.892、31.613±0.911)(p0.01),差異具有顯著統(tǒng)計學意義。 3.Western blot實驗結果： (1)claudin-4的表達情況(F=124.557,P=0.000)： a.與鹽水對照組相比,RA+LP+DMSO+pORF-LacZ、LP+DMSO+pORF-LacZ、 RA+DMSO+pORF-LacZ三組目的蛋白-claudin-4的表達量(分別為0.208±0.018、0.241±0.020、0.285±0.017)顯著低于前者的蛋白表達(0.458±0.031)(p0.01),差異具有統(tǒng)計學意義； b.與DMSO+pORF-LacZ組相比,RA+LP+DMSO+pORF-LacZ、 LP+DMSO+pORF-LacZ、RA+DMSO+pORF-LacZ三組目的蛋白-claudin-4的表達量(分別為0.208±0.018、0.241±0.020、0.285±0.017)顯著低于前者的蛋白表達(0.410±0.030)(p0.01),差異具有統(tǒng)計學意義。 c.與RA+DMSO+pORF-LacZ組相比,RA+LP+DMSO+pORF-LacZ、 LP+DMSO+pORF-LacZ組目的蛋白-claudin-4的表達量(分別為0.208±0.018、0.241±0.020)顯著低于前者的蛋白表達(0.285±0.017)(p0.01),差異具有統(tǒng)計學意義； d. RA+LP+DMSO+pORF-LacZ組目的蛋白-claudin-4的表達量低于LP+DMSO+pORF-LacZ組(分別為0.208±0.018、0.241±0.020)(p0.05),差異具有統(tǒng)計學意義； (2)zo-1蛋白表達情況(F=64.080,P=0.000)：a.與鹽水對照組相比,RA+LP+DMSO+pORF-LacZ、LP+DMSO+pORF-LacZ、 RA+DMSO+pORF-LacZ三組目的蛋白—zo-1的表達量(分別為0.541±0.054、0.789±0.076、0.955±0.064)顯著低于前者的蛋白表達(1.129±0.093)(p0.01),差異具有統(tǒng)計學意義； b.與DMSO+pORF-LacZ相比,RA+LP+DMSO+pORF-LacZ、 LP+DMSO+pORF-LacZ兩組目的蛋—zo-1的表達量(分別為0.541±0.054、0.789±0.076)顯著低于前者的蛋白表達(1.067±0.069)(p0.01), RA+DMSO+pORF-LacZ目的蛋白—zo-1的表達量(0.955±0.064)低于DMSO+pORF-LacZ組蛋白表達(1.067±0.069)(p0.05),差異具有統(tǒng)計學意義；c.與RA+DMSO+pORF-LacZ組相比,RA+LP+DMSO+pORF-LacZ、 LP+DMSO+pORF-LacZ兩組目的蛋白—zo-1的表達量(分別為0.541±0.054、0.789±0.076)顯著低于前者蛋白表達(0.955±0.064)(p0.01),DMSO+pORF-LacZ目的蛋白—-zo-1的表達量(1.067±0.069)高于RA+DMSO+pORF-LacZ組的蛋白表達(0.955±0.064)(p0.05),差異具有統(tǒng)計學意義。 d. RA+LP+DMSO+pORF-LacZ組目的蛋白—zo-1的表達量顯著低于LP+DMSO+pORF-LacZ組(分別為0.541±0.054、0.789±0.076)(p0.05),差異具有統(tǒng)計學意義。 結論：LP/RA/DMSO單獨或者聯(lián)合干預均能不同程度地降低小鼠皮膚claudin-4、zo-1蛋白表達量,其中,LP+RA+DMSO干預的效果最為明顯,LP+DMSO次之,RA+DMSO再次,說明通過TLR2抑制劑LP抑制TLR2信號通路可以下調小鼠皮膚連接蛋白claudin-4和ZO-1的表達,降低皮膚緊致度,改變緊密連接(tight junction,TJ)的固有結構,從而為增加報告基因pORF-LacZ對小鼠皮膚的透過效率創(chuàng)造條件。但是此過程中claudin-4、ZO-1的表達降低和TJ皮膚屏障作用改變的程度和時限需要進一步研究和評估,以保障皮膚正常的防御能力不受影響。TLR2抑制劑LP不僅能夠增強小鼠皮膚對藥物或者基因的透過效率,同時也能減輕DMSO所引起的微小皮膚損害,可以作為一種有效而安全的藥物或者基因透過皮膚的增強劑。本實驗為今后將治療基因或者藥物通過透皮傳輸發(fā)揮治療作用奠定研究基礎。 第三章：RA和LP對pORF-lacz基因透皮效率影響的實驗研究研究目的：經10%DMSO作為促滲劑,維甲酸(RA)和TLR2抑制劑--脂質羊毛硫氨酸肽(LP)按照分組施加干預后,測定報告基因pORF-lacz透過小鼠皮膚進入血液中數(shù)量的情況,以此探討LP/RA/DMSO對基因透皮效率的影響。研究方法：選取8周齡清潔級健康雄性Balb/c小鼠(購買于南方醫(yī)科大學動物實驗中心)30只,體重20-22g。實驗室環(huán)境：環(huán)境溫度為22.0±2.0℃,相對濕度55.6%±4%。將小鼠隨機分為5組：RA+LP+DMSO+pORF-LacZ; DMSO+pORF-LacZ; LP+DMSO+pORF-LacZ; RA+DMSO+pORF-LacZ;生理鹽水對照組,每組6只。 按如下步驟進行操作：選取8周齡小鼠背部一定面積(1cm×1cm)的皮膚,用脫毛膏脫出此選定皮膚區(qū)域的毛發(fā),3-5min后,用0.9%氯化鈉溶液處理,15min后,按照分組,小鼠背部皮膚分別被涂抹20u1含0.05%維甲酸(RA)(維甲酸溶于0.9%氯化鈉溶液中)+10%DMSO制劑和20u1的濃度為1%TLR2抑制劑LP+10%DMSO制劑,或者涂抹兩者的聯(lián)合制劑+10%DMSO制劑,或者10%DMSO制劑,這個過程每隔一天進行一次,連續(xù)1周,對照組作同樣處理。第7天,最后用上述相應制劑處理后,施用最適濃度10%DMSO配置的pORF-LacZ質粒,處理過程進行3天,每天1次,第4天處死小鼠,收集血液標本,隨后應用RT-PCR檢測血液中的pORF-LacZ質粒表達量。 研究結果： a.鹽水對照組的pORF-LacZ基因透皮表達量最低(0.897±0.228μg/cm2), RA+LP+DMSO組的pORF-LacZ基因透皮表達量則最高(5.310±0.273μg/cm2),差異具有統(tǒng)計學意義(p0.01)； b. LP+DMSO組(3.632±0.219μg/cm2)、RA+DMSO組(2.948±0.289μg/cm2)和DMSO組(2.070±0.23μg/cm2)的基因透皮表達量都低于RA+LP+DMSO組(5.310±0.273μg/cm2)(p0.05)、顯著高于鹽水對照組(0.897±0.228μg/cm2)(p0.01),差異具有統(tǒng)計學意義。 c. LP+DMSO組、RA+DMSO組和DMSO組三組之間比較：LP+DMSO組的基因透皮表達量(3.632±0.219μg/cm2)最高,DMSO組基因透皮表達量(2.070±0.231μg/cm2)則最低,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。F=265.903,P=0.000 結論：LP/RA/DMSO單獨或者聯(lián)合干預均能不同程度地提高報告基因pORF-LacZ的透皮表達量,其中,LP+RA+DMSO干預的效果最為明顯,LP+DMSO次之,RA+DMSO再次,與干預后小鼠皮膚claudin-4、zo-1蛋白表達量下降程度相一致,說明通過LP抑制TLR2信號通路可以增加報告基因pORF-LacZ對小鼠皮膚的透過效率,其機制可能是通過下調小鼠皮膚連接蛋白claudin-4和ZO-1的表達,降低皮膚緊致度,暫時打破緊密連接(tight junction,TJ)所起的皮膚屏障作用。今后將進一步研究如何改進LP/RA/DMSO的配比效率,并對某些具體藥物或者治療基因的透皮表達量進行詳細研究,觀察LP/RA/DMSO制劑對藥物和基因透皮吸收并改善皮瓣缺血損傷、提高皮瓣成活率的作用。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R965
【圖文】：

Figure 5 The RT-PCR dissolution curve of GAPDH表1，圖1均表不在不同濃度DMSO混合制劑作用下，報告基因pORF-lacz的各透皮表達量。本研究各組數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差（7±s)表示。運用SPSS17.0版統(tǒng)計軟件包進行分析。不同DMSO濃度的組間多重比較采用LSD檢驗（正太分布并且方差齊時）或者Tamhane’s T2(M)檢驗（方差不齊時）。P<0.05表示差異具存統(tǒng)計學意義；po.oi表示差異具Q囅災醞臣蒲б庖�。III表1，圖1"]■知在不同濃度DMSO混合制劑的作用下，報告基因pORF-lacz透皮表達量分別為：a.當DMSO濃度為10%時，口011?七02基因透皮表達量最高(5.378±0.346^18/咖2；),顯著性高于另外三組，差異具Q囃臣蒲б庖�；b.DMSO濃度為0時，pORF-lacz基因透皮表達量最低(0.940±0.095ng/cm2：)，顯著性低于另外三組，差異具有統(tǒng)計學意義；C.而DMSO濃度為5%和30%時，pORF-lacz基因透皮表達量居中（分別為2.376±0.190^18/(012和2.516±0.199^ig/cm2)兩者之間差異并無統(tǒng)計學意義。

，M：：圖6 干預后的實驗組小鼠和對照組小鼠皮膚的HE染色注：圖片A: RA+LP+DMSO組 圖片B: LP+DMSO組 圖片C: RA+DMSO組 圖片D; DM SO組 圖片E和圖片F(xiàn):鹽水對照組根據(jù)HE染色圖片所示：DMSO、RA和LP干預后的實驗組小鼠皮膚角質層細胞連接間隙增大，細胞連接疏松，對照組小鼠的皮膚并未出現(xiàn)上述現(xiàn)象；所有的實驗組小鼠皮膚并未出現(xiàn)病理性的破壞。在各實驗組中，DMSO組和36

注：圖片 A: RA+LP+DMSO 組 圖片 B:LP+DMSO 組 C: RA+DMSO 組 圖片D:DMSO組圖片E和圖片F(xiàn):鹽水對照組目的蛋白呈陽性反應，呈現(xiàn)棕黃色。

【參考文獻】

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1 趙文華;夏雪山;;Toll樣受體研究進展[J];動物醫(yī)學進展;2007年10期

2 史霖,范桂香,袁育康;DNA CpG特征結構免疫學研究進展[J];國外醫(yī)學(免疫學分冊);1999年05期

3 張臨友;修殿輝;楊寶峰;;Toll樣受體與免疫排斥[J];國際免疫學雜志;2006年04期

4 徐大為,陳四平,孫肖紅;TLRs研究進展[J];承德醫(yī)學院學報;2003年03期

5 孫午;熊鶯;傅穎媛;;Toll樣受體的研究進展[J];實驗與檢驗醫(yī)學;2008年04期

6 潘鳳蘭;陳哲生;;人類固有免疫細胞膜的Toll樣受體的免疫功能[J];檢驗醫(yī)學教育;2007年01期

7 李軍,富寧;Toll樣受體-9的研究進展[J];免疫學雜志;2004年S1期

8 趙永剛;周艷春;李明才;蘇紹波;;TLR/MyD88信號通路與自身免疫性疾病[J];生命的化學;2008年04期

9 徐斌;劉振中;蔡景龍;;重組CDglyTK雙自殺基因腺病毒對瘢痕疙瘩成纖維細胞周期的影響[J];中國美容整形外科雜志;2007年05期

10 唐深;TLR家族及其功能研究進展[J];微生物學免疫學進展;2004年02期

本文編號：2805116