發(fā)布時間：2020-08-21 07:15

【摘要】：研究背景壞死,是眾多疾病發(fā)生和發(fā)展過程中常見的病理改變。壞死和各種疾病的關(guān)系可以用“如影隨形”來形容�？烧怯捎趬乃肋@一現(xiàn)象在疾病的發(fā)生和發(fā)展中過于常見和不可逆轉(zhuǎn),研究壞死組織和研究活組織比較起來,似乎價值不大。然而,“生與死”是對立統(tǒng)一的,只有對“死”有客觀、精準(zhǔn)的了解,才能更好的評估“生”的狀態(tài)和預(yù)后。因為壞死往往是疾病惡化的一種表現(xiàn),也是促使疾病惡化的原因之一。只有對壞死的程度、分布、趨勢有精準(zhǔn)的把握,才能指導(dǎo)醫(yī)師實施有效的干預(yù)措施,實現(xiàn)對壞死趨勢的控制和扭轉(zhuǎn),達(dá)到挽救組織、器官乃至個體生命的目的。尤其是在人體的一些重要器官(如：心、腦等),即使是微小的壞死病灶,如果沒有被及時發(fā)現(xiàn)和干預(yù),將產(chǎn)生致死性的后果。壞死可以發(fā)生于機(jī)體自身的正常組織,也可以發(fā)生在機(jī)體新生組織(最常見和重要的是惡性腫瘤組織)。對于前者而言,壞死范圍的擴(kuò)大或縮小,往往意味著疾病的惡化或緩解。對于后者而言,特別是惡性腫瘤內(nèi)發(fā)生的壞死,不但能通過自發(fā)性壞死的程度和速度來間接評估腫瘤的惡性程度；還可以通過治療性壞死的程度和速度來評估抗腫瘤治療的效果。因而,無論是臨床前的動物實驗研究還是臨床上的疾病干預(yù)治療過程,都需要對機(jī)體組織的壞死范圍、程度有一個精準(zhǔn)的診斷和把握。對壞死的診斷,除了利用常規(guī)的臨床表現(xiàn)來判斷,更為客觀的方式是通過相應(yīng)的影像學(xué)技術(shù)手段來實現(xiàn)。然而,已有的傳統(tǒng)影像學(xué)手段,尚難以完全滿足上述的要求。通過特殊的影像學(xué)手段對機(jī)體各種壞死組織進(jìn)行客觀、實時、精準(zhǔn)和全面的診斷,具有重要的科研和臨床應(yīng)用價值。因而,近年來的諸多研究都致力于探索出一種能實時、全面精準(zhǔn)的評估機(jī)體壞死情況的影像學(xué)手段,以及相應(yīng)的影像學(xué)介質(zhì)。臨床上現(xiàn)有的診斷壞死的方法,包括間接法和直接法。間接法是借助現(xiàn)有的各種影像學(xué)手段(如：DUS、CT、MRI或PET-CT等)加上血管造影劑來間接診斷缺血組織。例如：吲哚菁綠(indocyanine green, ICG)已經(jīng)被作為血管熒光造影劑,用于識別缺血組織。經(jīng)靜脈注射后,ICG不能到達(dá)的部位,被認(rèn)為是缺乏血供而可能是壞死組織。然而,缺血組織并不是一定就是壞死組織。因為在疾病演變中,有不少可逆性的缺血組織,最終可以恢復(fù)活力,而間接法造影無法判斷可逆和不可逆性缺血。同時,血管造影的時間一般比較短暫,如ICG只有幾分鐘的時間。故而不利于在外科手術(shù)中動態(tài)、實時的觀察壞死情況,不利于實現(xiàn)壞死組織清除的手術(shù)導(dǎo)航。而直接法是通過借助具有特異性靶向壞死組織的物質(zhì),實現(xiàn)對壞死組織的直接標(biāo)定和顯影,來實現(xiàn)比間接法更為精準(zhǔn)的壞死診斷(如：同位素標(biāo)定的金絲桃素)。然而,由于傳統(tǒng)影像學(xué)手段的一些局限性(如：同位素釋放的伽馬射線成像的解析度低),使得同時實現(xiàn)高靈敏度的偵測壞死病灶、準(zhǔn)確界定壞死組織和活組織的邊界、持續(xù)動態(tài)的觀測壞死的演進(jìn),成為了需要突破的焦點問題。熒光分子影像作為一種具有高分辨率和優(yōu)異的邊界界定能力的影像學(xué)手段,已經(jīng)在臨床和試驗研究中,顯示了其廣泛的應(yīng)用前景。然而,這種影像手段之所以還沒有被很好的應(yīng)用于臨床的壞死組織診斷,是因為缺乏一種對壞死組織具有特異性標(biāo)定的熒光物質(zhì)。典型的熒光靶向性材料,是由信號源熒光物質(zhì)和靶向性材料(如：抗體或肽段等)通過共價結(jié)合而合成的。雖然這種設(shè)計在臨床前的試驗中有效,但是由于兩種分子結(jié)合后,分子量變大,不容易進(jìn)入目標(biāo)組織,而且這些新合成的物質(zhì),需要經(jīng)過漫長的驗證試驗,才能通過藥監(jiān)局的認(rèn)可,應(yīng)用于臨床。因而,臨床很需要有一種可以在臨床使用的對壞死組織具有特異性靶向能力的小分子熒光物質(zhì)。這種物質(zhì)將有望幫助臨床醫(yī)生實現(xiàn)高敏感性和高特異性的診斷和治療與壞死相關(guān)的疾病。ICG是一種小分子熒光物質(zhì)。它可以在一定波長的外來光激發(fā)下,釋放出近紅外波譜的熒光。這種熒光和可見光相比具有更優(yōu)異的組織穿透能力,能更好的應(yīng)用于活體成像。因而,近年來ICG廣泛的被應(yīng)用于動物和人體的光學(xué)成像。在此基礎(chǔ)上,我們的實驗團(tuán)隊首先發(fā)現(xiàn)了：ICG由于自身的分子結(jié)構(gòu)特點,經(jīng)靜脈注射后,通過其在機(jī)體內(nèi)與脂蛋白和磷脂的相互作用,能實現(xiàn)對壞死組織的靶向標(biāo)定。雖然ICG已經(jīng)被批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床40余年,但它的這一特性卻一直未被發(fā)現(xiàn)和闡明。進(jìn)一步的,我們通過一系列實驗室的、在體的和體外的試驗初步探索了ICG親和壞死組織的機(jī)理,還改進(jìn)了ICG靜脈給藥的方式,實現(xiàn)了目標(biāo)信背比的大幅提高。在此基礎(chǔ)上,通過自行改裝的熒光顯微鏡的協(xié)助,我們實現(xiàn)了近紅外熒光影像導(dǎo)航下的裸鼠壞死組織清除手術(shù)。在術(shù)中,近紅外熒光信號充分顯示了其高靈敏度和對壞死邊界界定的精準(zhǔn)性。綜上,ICG靶向機(jī)體壞死組織的特性,結(jié)合其快速的臨床轉(zhuǎn)化能力,可以被廣泛的應(yīng)用于壞死相關(guān)疾病的診斷和更為精準(zhǔn)的個體化治療。材料與方法試劑：ICG采購自丹東醫(yī)藥有限責(zé)任公司。該藥已經(jīng)被批準(zhǔn)在臨床使用。胎牛血清(FBS)購買自北京生物技術(shù)公司。磷脂酰膽堿購(PC)買自Sigma北京有限責(zé)任公司。磷酸鹽緩沖液(PBS)為自行配制。細(xì)胞水平的機(jī)制探索：同代的4T1乳腺癌細(xì)胞(由中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院贈送)用于比較游離ICG和ICG+脂蛋白(LP)分別與活細(xì)胞和壞死細(xì)胞的親和性。通過使用無菌純水使細(xì)胞水腫壞死。在顯微鏡下觀察直到確認(rèn)細(xì)胞水腫、破裂壞死。以1 μg/ml的濃度,將ICG分別溶解于PBS和FBS中,再將這兩種溶液與活的4T1細(xì)胞一同孵育30分鐘。其后用PBS液洗脫ICG和ICG+LP3次。壞死細(xì)胞碎屑經(jīng)離心沉淀后,去除上清液,再分別加入上述兩種溶液孵育30分鐘。離心后去除上清液,加入PBS液混勻后離心,重復(fù)3次,以去除未結(jié)合的ICG。然后,將上述的活細(xì)胞和細(xì)胞碎屑在我們改造的熒光顯微鏡下拍攝可見光和熒光圖像。上述試驗均重復(fù)3次。分子水平的機(jī)制探索：ICG以1 μg/ml的濃度分別溶解于PBS和FBS液體。將ICG的PBS溶液200μl加入96孔板的第一個孔；ICG的FBS溶液200μl加入96孔板的第二個孔；第三個孔在200 nl ICG+FBS中加入飽和的PC。上述加樣過程重復(fù)兩次,分別加樣在對應(yīng)成分的下方。整個加樣及測試過程環(huán)境溫度均為37℃。將96孔板放置于小動物活體成像系統(tǒng)(IVIS)的視野內(nèi),自動拍攝其近紅外熒光。動物實驗：所有的動物試驗均經(jīng)過了南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。動物在拍攝影像和手術(shù)時均采用異氟烷氣體麻醉。處死動物采用水合氯醛腹腔注射。動物包括Balb/c裸鼠和,Sprague-Dawley(SD)大鼠。雌性裸鼠用于建立乳腺癌模型,其余裸鼠均為雄性。ICG親和壞死組織機(jī)制在體探索：裸鼠燒傷壞死模型和裸鼠肌肉缺血壞死模型分別由808激光器發(fā)射的激光燒灼制造和手術(shù)阻斷下肢肌肉血供24小時制造。上述兩種模型均給予0.5mg/kg體重的ICG靜脈注射。然后在IVIS下記錄各指定時間點的近紅外光光強值。感興趣區(qū)分別為后肢壞死區(qū)域和對側(cè)肢體對稱的相同區(qū)域范圍的正常組織。燒傷壞死模型裸鼠在觀察到第9天以后,予以處死,左側(cè)下肢解剖后,行TTC染色(一種體外壞死組織染色法),再在熒光顯微鏡下拍攝可見光和熒光圖像。信背比(SBR)增強試驗：12只燒傷壞死裸鼠,分為兩組。對照組給予一次性注射ICG2.0mg/kg體重。實驗組給予間隔3小時的ICG注射,每次劑量為0.5mg/kg體重。兩組同時注射完畢后,均在IVIS下測試其在四個時間點的熒光強度。感興趣區(qū)的設(shè)定同前。自行改造的近紅外熒光顯微鏡：采用萊卡公司生產(chǎn)的體視熒光顯微鏡,加裝了普林斯頓器材有限公司的低溫CCD作為熒光信號的采集設(shè)備。提示熒光顯微鏡可以將光路分別導(dǎo)向彩色相機(jī)和低溫CCD。分別采集可見光和熒光圖像。在動物或離體標(biāo)本成相時,光圈采用F1.4；曝光時間為0.1秒。在對病理切片成像時參數(shù)采用光圈F1.4；曝光時間1.0秒。由于彩色照相機(jī)和低溫CCD的視野有細(xì)微差異,我們專門設(shè)計了一套軟件,以實現(xiàn)白光圖像和熒光圖像的融合。壞死邊界的界定和小壞死病灶的偵測：我們建立了4T1乳腺癌自發(fā)性壞死的裸鼠模型；裸鼠大腦的部分激光燒灼壞死模型；SD大鼠的胃潰瘍模型和裸鼠肝臟的部分酒精消融壞死模型。分別給予ICG注射,然后在最佳時間點(注射后24小時)將裸鼠和SD大鼠處死,取得相應(yīng)標(biāo)本。前兩種模型的標(biāo)本行TTC壞死染色；后兩種模型在拍攝標(biāo)本的白光和熒光圖像后,再行冰凍切片機(jī)和HE染色,接著拍攝切片的熒光和白光圖像。術(shù)中的熒光手術(shù)導(dǎo)航的臨床前驗證試驗：3只燒傷壞死模型小鼠,于術(shù)前24小時靜脈注射ICG0.5mg/kg體重。術(shù)中,先由外科醫(yī)師行切痂術(shù),再用改裝后的熒光顯微鏡導(dǎo)航殘余壞死組織的清除。3只耐甲氧西林金黃色葡萄球菌性裸鼠皮下膿腫模型。術(shù)前24小時給予ICG注射。術(shù)中先由外科醫(yī)生手術(shù)清除膿腫。再在熒光顯微鏡下檢測和導(dǎo)航殘余壞死組織的清除。統(tǒng)計學(xué)方法：統(tǒng)計學(xué)軟件采用GraphPad Prism 5軟件。比較兩組數(shù)據(jù)采用Student'st檢驗。SBR值描述為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。規(guī)定P值小于0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果ICG靶向壞死組織的機(jī)理研究1、細(xì)胞水平的機(jī)理探索ICG的PBS溶液與活的4T1細(xì)胞共同孵育后,在體式熒光顯微鏡下,細(xì)胞均發(fā)出近紅外熒光,說明ICG在水溶液中的游離狀態(tài)下,能夠與細(xì)胞膜表面的成分結(jié)合。ICG的PBS溶液與壞死的4T1細(xì)胞碎屑共同孵育后,在體式熒光顯微鏡下,所有細(xì)胞碎屑均發(fā)出近紅外熒光,說明ICG在水溶液中的游離狀態(tài)下,能夠與不完整的細(xì)胞碎屑結(jié)合。ICG的FBS溶液與活的4T1細(xì)胞共同孵育后,在體式熒光顯微鏡下,活細(xì)胞均沒有近紅外熒光信號釋放,說明ICG與脂蛋白結(jié)合后,不能與活細(xì)胞完整的脂質(zhì)雙分子層外表面的分子基團(tuán)結(jié)合。ICG的FBS溶液與壞死細(xì)胞碎屑共同孵育后,在體式熒光顯微鏡下,細(xì)胞碎屑均能發(fā)出近紅外熒光。說明ICG與脂蛋白結(jié)合后,能夠與不完整的脂質(zhì)雙分子層或者細(xì)胞內(nèi)成分結(jié)合。2、分子水平的機(jī)理探索在ICG+PBS組、ICG+FBS組和ICG+FBS+PC組,IVIS系統(tǒng)檢測獲得的近紅外熒光強度顯示：ICG+FBS+PC組的熒光強度平均值比ICG+FBS組高出105.84%,P0.001)。說明PC和脂蛋白的復(fù)合物和ICG的相互作用,明顯提升了ICG的發(fā)光效率ICG靶向壞死組織的在體和體外規(guī)律的探索1、燒傷壞死模型和缺血壞死模型上的規(guī)律探索(1)ICG注射后燒傷壞死模型的熒光特點在ICG靜脈注射后的24小時內(nèi),測量的5個時間點目標(biāo)感興趣區(qū)和對照感興趣區(qū)的圖像和光強值�？梢娫贗CG注射的初期。壞死組織的光強值是低于正常組織的,但是隨著時間的推移,壞死組織的熒光消減速度在逐步下降,而正常組織的熒光強度消減得更加快速。在超過6小時以后,所有時間點的壞死組織光強值都高于正常組織。同一時間點的壞死組織光強值比上正常組織光強值所獲得的所謂信背比SBR的均數(shù)值,能更直觀的顯示：SBR從注射初期的小于1,逐步上升到24小時的約4倍�？梢�,正常組織的熒光消退速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于壞死組織。從ICG注射后1天、5天、9天時的壞死組織和正常組織的光強值,可見壞死組織的光強值呈緩慢下降趨勢,而正常組織的光強值呈相對穩(wěn)定狀態(tài),有輕微下降。24小時到第9天,壞死組織和正常組織間的光強比值SBR也呈現(xiàn)為緩慢的下降趨勢,但是即使在ICG注射9天以后,SBR仍然能達(dá)到2左右。(2)ICG注射后缺血—再灌注壞死模型的熒光特點在ICG靜脈注射后的24小時內(nèi),測量的5個時間點目標(biāo)感興趣區(qū)和對照感興趣區(qū)的圖像和光強值。可見在ICG注射的初期。壞死組織的光強值就已經(jīng)高于正常組織,隨著時間的推移,壞死組織的熒光消減速度在逐步下降,而正常組織的熒光強度消減得更加快速。在6小時以內(nèi),正常組織內(nèi)的熒光消減顯著快于壞死組織。用同一時間點的壞死組織光強值比上正常組織光強值所獲得的所謂信背比SBR的均數(shù)值,更直觀的顯示：SBR從注射初期就已經(jīng)超過1,逐步上升到6小時的峰值約5倍�？梢�,正常組織的熒光消退速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于壞死組織。ICG注射后1天、5天、9天時的壞死組織和正常組織的光強值。可見壞死組織的光強值呈緩慢下降趨勢,而正常組織的光強值呈相對穩(wěn)定狀態(tài),有輕微下降。壞死組織和正常組織間的光強比值SBR也呈現(xiàn)為緩慢的下降趨勢,但是即使在ICG注射9天以后,SBR仍然能達(dá)到2左右。2、TTC壞死組織染色法結(jié)果與熒光結(jié)果的比對按前述方法進(jìn)行標(biāo)本處理和TTC染色后,將染色后的標(biāo)本放置于我們改建的體式熒光顯微鏡下檢測并拍攝可見光和熒光的圖像�？梢悦黠@的看出,熒光影像的范圍,邊界和TTC染色后標(biāo)本的白色部分(即壞死部分)是完全吻合的。能增強壞死組織信背比的ICG注射方法在實驗組和對照組中,壞死組織的光學(xué)信號強度均大于其自身正常組織(P0.001)；但是在每個時間點,實驗組的SBR均為對照組2倍以上(P0.001)；其中在注射ICG后24小時的實驗組,SBR最高達(dá)值到了9.28±0.29。在不同組織器官的驗證試驗1、4T1乳腺癌自發(fā)性壞死模型的驗證試驗裸鼠4T1腫瘤壞死模型的癌腫標(biāo)本經(jīng)剖開后,在體式熒光顯微鏡下觀察。發(fā)現(xiàn)腫瘤的中心區(qū)域有不規(guī)則的近紅外熒光信號,而腫瘤內(nèi)的外圍區(qū)域沒有明顯的熒光信號。經(jīng)TTC壞死染色法處理后的標(biāo)本,在顯微鏡下,其紅色區(qū)域(活組織)沒有ICG熒光信號；其白色區(qū)域(壞死組織)與ICG釋放的近紅外熒光信號完全吻合。2、裸鼠左側(cè)腦組織激光燒傷模型的驗證試驗裸鼠左側(cè)腦組織激光燒傷模型(圖5：b),經(jīng)冰凍切片機(jī)剖開后,在體式熒光顯微鏡下觀察。左側(cè)近顱骨處有球形近紅外熒光團(tuán),其他部位腦組織無熒光信號。經(jīng)TTC壞死組織染色法染色后的腦標(biāo)本,除左側(cè)近顱骨處有一團(tuán)塊狀腦組織呈現(xiàn)白色(壞死組織)外,其余腦組織呈紅染。而近紅外熒光信號與腦組織的白色區(qū)域完全吻合。3、SD大鼠胃潰瘍模型的驗證試驗SD大鼠的胃潰瘍模型在剖開胃大彎后,平鋪于體式熒光顯微鏡下觀察。經(jīng)放大后仔細(xì)尋找,很難快速的定位微小潰瘍病灶的位置。經(jīng)近紅外影像顯示后,立即在全黑的胃組織背景中,顯示出直徑在0.6mm級別的熒光團(tuán)。然后再在同一位置用可見光圖像觀察,發(fā)現(xiàn)確實有一處“火山樣”的疑似病灶。其位置與熒光團(tuán)所在位置一致。其后,將該標(biāo)本制作成的HE染色后的病理切片,在體式熒光顯微鏡下檢測。熒光信號所在的區(qū)域與切片組織中的壞死區(qū)域完全吻合,邊界清晰。6只大鼠潰瘍直徑的平均值：1.0±0.3mm,其中能偵測到的最小的潰瘍病灶,直徑只有0.6mm。4、肝臟局部壞死模型的驗證試驗裸鼠的肝臟無水酒精消融壞死模型的肝臟整體標(biāo)本,被放置于體式熒光顯微鏡下觀察。近紅外熒光所在的位置與與肉眼可以辨識的黃白色壞死區(qū)域在同一位置,但近紅外光影像的范圍要大于肉眼辨識的壞死組織范圍。其后,將將該標(biāo)本制作成的HE染色后的病理切片,在體式熒光顯微鏡下檢測。結(jié)果顯示：HE染色識別的壞死區(qū)域與ICG熒光的分布完全一致。甚至在一圈壞死組織環(huán)繞的一小塊正常組織也沒有熒光信號。術(shù)中的熒光手術(shù)導(dǎo)航的臨床前驗證試驗：1、燒傷壞死模型近紅外熒光導(dǎo)航手術(shù)在燒傷模型手術(shù)中,醫(yī)師憑借肉眼在目鏡直接觀測下,切除燒傷痂皮。當(dāng)醫(yī)師主觀認(rèn)為壞死組織已經(jīng)清除完成后。再在熒光下檢視,發(fā)現(xiàn)仍然有熒光殘余。進(jìn)而在熒光導(dǎo)航下繼續(xù)清除帶有熒光的物質(zhì),直至熒光影像呈現(xiàn)為完全黑色影像。2、細(xì)菌性皮下膿腫模型近紅外熒光導(dǎo)航手術(shù)在皮下膿腫模型手術(shù)中,切開皮膚,無菌棉簽拭去膿液后,醫(yī)師在目鏡下觀測,主觀認(rèn)為膿液已經(jīng)清除完全。再用熒光圖像導(dǎo)航,發(fā)現(xiàn)仍然有菲薄的一層壞死組織和正常組織貼附緊密,無法拭去。故醫(yī)師在熒光導(dǎo)航下用金屬刮匙清除全部熒光物質(zhì),直到熒光影像成為全黑狀態(tài)。結(jié)論1、ICG靶向機(jī)體壞死組織的機(jī)理,經(jīng)過初步探索以后結(jié)論是：ICG經(jīng)靜脈注射后,與血液中的脂蛋白結(jié)合,然后該復(fù)合物透過壞死周圍不完整的血管內(nèi)皮間隙,到達(dá)壞死組織。復(fù)合物選擇性的與壞死組織中的磷脂疏水端結(jié)合,而不與正常細(xì)胞表面的磷脂親水端結(jié)合。2、經(jīng)過我們對ICG靜脈注射方法的改進(jìn),即將相同劑量的ICG用更緩慢的速度注射到血液系統(tǒng),能夠?qū)崿F(xiàn)讓更多的ICG脂蛋白復(fù)合物進(jìn)入壞死區(qū)域,進(jìn)而增強壞死組織和背景間熒光強度的比值。3、以往文獻(xiàn)報道的,ICG能夠靶向肝癌以外的其他類型癌組織。這一觀點和我們的試驗結(jié)果間存在差異。我們的結(jié)論是ICG靶向的是腫瘤組織中的壞死組織成分。4、我們利用ICG來協(xié)助壞死組織的偵測和導(dǎo)航手術(shù)的方法,具有極高的敏感性和精準(zhǔn)度。該方法可以為壞死相關(guān)疾病的診斷和治療提供嶄新的技術(shù)平臺。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R63

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