【摘要】：目的:探討如何利用多種生物制劑參與的三維PCL支架誘導(dǎo)人工骨髓模型建立與評(píng)價(jià)。材料與方法:一、確認(rèn)新型萘醌類化合物對(duì)Wnt/β-Catenin/TCF信號(hào)通路的影響首先對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞和SW480細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),在兩種細(xì)胞中分別添加5μM濃度的41種萘醌類化合物,進(jìn)行細(xì)胞生長抑制實(shí)驗(yàn),初篩出具有較高細(xì)胞抑制作用的化合物,再次將這些化合物從低到高多種濃度進(jìn)行細(xì)胞生長抑制實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn),根據(jù)兩種實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算出各個(gè)化合物的IC_(50)值,根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的IC_(50)數(shù)值篩選出最具潛力化合物。然后進(jìn)行TOP/FOP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增、提取并轉(zhuǎn)染到HCT116細(xì)胞和SW480細(xì)胞中對(duì)篩選出的化合物進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn),得到抑制Wnt/β-Catenin通路最強(qiáng)的化合物。Co MFA分析,以最低能量的化合物23的構(gòu)象進(jìn)行構(gòu)象搜索,并以此作為模板建立其他類似物以確定分子定量結(jié)合和活性的關(guān)系。經(jīng)上述實(shí)驗(yàn)篩選,對(duì)最有價(jià)值的化合物在正常細(xì)胞中進(jìn)行細(xì)胞毒性測試,根據(jù)結(jié)果將最有潛力化合物應(yīng)用到整個(gè)實(shí)驗(yàn)的第二部分中。二、生物修飾PCL生物支架誘導(dǎo)異位骨髓形成及影響1)首先將MDA-MB-231/GFP細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)。MDA-MB-231/GFP細(xì)胞傳代后鋪設(shè)到含有PCL生物支架的96孔板中,48小時(shí)后顯微鏡下觀察以確定該P(yáng)CL支架適宜細(xì)胞生長。2)在或不在含有10 ng/m L的rh BMP-2的ATDC5細(xì)胞中分別添加Stem Regenin-1(SR1)、淫羊藿苷和萘醌類化合物N27。72小時(shí)后進(jìn)行ALP活性測試,確定在ATDC5細(xì)胞中添加不同生物制劑后對(duì)ALP活性的影響。3)在小鼠腹部皮下埋置添加不同生物制劑的PCL支架,根據(jù)PCL支架上添加物質(zhì)不同分為7組,分別為第一組(空白對(duì)照組):僅在PCL支架上添加PBS/0.1%BSA/0.1%DMSO;第二組:PCL支架上添加10μg的rh BMP-2;第三組:PCL支架上添加10μL Matrigel+10μg的rh BMP-2;第四組:PCL支架上添加2mg HA+10μL Matrigel+10μg的rh BMP-2;第五組:PCL支架上添加20μg SR1+2mg HA+10μL Matrigel+10μg的rh BMP-2;第六組:PCL支架上添加40μg淫羊藿苷+2mg HA+10μL Matrigel+10μg的rh BMP-2;第七組:PCL支架上添加40μg N27+2mg HA+10μL Matrigel+10μg的rh BMP-2。4)小鼠術(shù)后皮下埋置支架八周之后,對(duì)小鼠麻醉進(jìn)行活體Micro-CT測量,確定小鼠皮下小骨形成情況。5)小鼠安樂死后取出小骨固定、脫鈣、切片,進(jìn)行HE染色和masson三色染色確定各組小骨內(nèi)組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞組成,并進(jìn)行比較分析。6)從小鼠體內(nèi)取出小骨后,反復(fù)沖洗小骨收集小骨內(nèi)細(xì)胞,進(jìn)行造血集落形成實(shí)驗(yàn),確定新生小骨中造血祖細(xì)胞和造血前體細(xì)胞的頻數(shù)。7)收集小骨內(nèi)細(xì)胞,利用抗Sca-1-FITC抗體在流式細(xì)胞檢測Sca-1+的細(xì)胞,確定小骨中存在HSCs。結(jié)果:一、確認(rèn)新型萘醌類化合物對(duì)Wnt/β-Catenin/TCF信號(hào)通路的影響。1.篩選有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的化合物41種化合物濃度在5μM時(shí)對(duì)兩種細(xì)胞生長抑制百分比,篩選出所有化合物中具有較高細(xì)胞生長抑制作用(抑制率50%),進(jìn)而測試它們IC_(50)值,其中化合物23和化合物27帶有磺酰胺結(jié)構(gòu)具有較低IC_(50)值(2μM),對(duì)HCT116細(xì)胞和SW480細(xì)胞生長具有較強(qiáng)抑制作用。而磺酰胺衍生物化合物24和25對(duì)SW480細(xì)胞株選擇性抑制。2.代表性化合物在β-Catenin/TCF信號(hào)通路中的生物學(xué)特征篩選出的這六個(gè)化合物4、27、31和23-25,分別測定它們?cè)赟W480和HCT116細(xì)胞熒光素酶活性的抑制作用,磺酰胺化合物27表現(xiàn)出的最有力的抑制作用。它的IC_(50)值在SW480和HCT116細(xì)胞中分別為2.1μM和2.5μM。3.代表性的化合物在β-catenin高表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞中抑制集落形成的實(shí)驗(yàn)結(jié)果六種化合物(4,23,24,25,27,31)以劑量依賴的方式顯著抑制集落形成,所有化合物的IC_(50)值均小于2μM(表2,圖2)。其中磺酰胺結(jié)構(gòu)的化合物23和27是最有效,結(jié)果顯示化合物23和27的IC_(50)值在SW480細(xì)胞中分別為346n M和343n M,它們?cè)贖CT116細(xì)胞中IC_(50)值分別為390n M和348n M。4.Co MFA分析生物活性和Co MFA分析相結(jié)合展現(xiàn)了這些化合物初步結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系(見表1,2和圖3)。(1)立體輪廓顯示的主要地區(qū)(綠色)圍繞2-胺類生物活性的貢獻(xiàn)。二取代2-胺類(化合物4和32)比單取代的更有潛力(化合物3)。(2)不利的Co MFA區(qū)域(黃色)顯示立體位阻效應(yīng)導(dǎo)致生物活性降低(例如化合物11和12)。(3)藍(lán)色的輪廓(正電性取代基分布)被分配到磺酰胺芳環(huán)附近,如果磺酰胺被攜帶π電子的芳香環(huán)所取代,活性可以增強(qiáng)(例如化合物22 vs 23-25)。(4)以萘醌為核3-氯類更具有抑制作用,3-氫類取代導(dǎo)致失去活性(23 vs 30,4 vs 29)。5.正常ATDC5細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)ATDC5細(xì)胞株是小鼠成軟骨細(xì)胞系,化合物23在藥物濃度分別為5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM和0.3125μM時(shí)ATDC5的相對(duì)活力分別為2.85±1.49%、16.36±10.9%、89.13±3.59%、95.15±1.98%以及95.36±6.14%。化合物27在同樣藥物濃度時(shí)ATDC5的相對(duì)活力分別79.34±2.67%、85.57±2.55%、96.45±4.18%、98.35±1.33%以及99.37±0.53%。由此可見化合物27對(duì)正常細(xì)胞的毒性更小。二、生物修飾PCL生物支架誘導(dǎo)異位骨髓形成及影響。1.鑒定PCL生物支架適合細(xì)胞生長48小時(shí)后倒置顯微鏡下觀察MDA-MB-231/GFP細(xì)胞在PCL支架上的生長情況�？梢娊^大部分細(xì)胞貼壁生長,形態(tài)呈較均一的梭形(見圖4、圖5)。2.ALP活性實(shí)驗(yàn)與rh BMP-2組比較,SR1+rh BMP-2組升高,P0.05。N27組和N27+rh BMP-2組比值則遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于rh BMP-2組,P0.05。與SR1+rh BMP-2組比較,其他各組比值均低于SR1+rh BMP-2組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05。單純SR1組、Icariin組和N27組間比較,P0.05,組間無顯著差異。與N27+rh BMP-2組比較,SR1+rh BMP-2組、Icariin+rh BMP-2(即添加rh BMP-2的各組間比較),差異性顯著,P0.05(見表3和附圖6)。3.Micro-CT檢測與空白對(duì)照組(Group1)比較,其他六組骨質(zhì)密度均明顯升高,P0.05。柱狀圖可見第五組增高最明顯,當(dāng)各組與第五組進(jìn)行比較,差異性顯著,P0.05。但是各組骨質(zhì)含量沒能達(dá)到小鼠脊柱水平,各組與小鼠脊柱密度比較時(shí)均有顯著性差異,P0.05(見表4和附圖8)。4.組織學(xué)染色圖9A-G是第一組至第七組脫鈣后HE染色結(jié)果,空白對(duì)照組(Goup1)沒有新骨形成,肉眼觀測各組間形成新骨有差別,其中在PCL支架上添加SR1+HA+Matrigel+rh BMP-2(即group5)形成較多新骨,其形態(tài)與PCL支架形狀相似,并成包裹樣結(jié)構(gòu),圖10是第五組masson染色結(jié)果,圖9和圖10的Scale bars:500μm。圖11A-C是HE染色結(jié)果,圖11A是空白對(duì)照組(group1),圖中可見紅細(xì)胞、增生性間充質(zhì)細(xì)胞以及較多血管,Scale bars:50μm。圖11B-C是第五組染色結(jié)果,可見新形成的骨和各系造血細(xì)胞,其中包括巨核細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞和成熟紅細(xì)胞,Scale bars:20μm。5.造血集落形成除小鼠本身骨髓標(biāo)本形成各類集落最多以外,第5組位居第二。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)在CFU-GEMM中,各組與第5組比較,第5組形成CFU-GEMM數(shù)量明顯高于其他各組,P0.05。在BFU-E中,各組與第5組比較,組2、組3、組4和組7明顯低于第5組,P0.05。在CFU-GM中,各組與第5組比較,組2、組3和組7明顯低于第5組,P0.05。在CFU-E中,與第5組比較,組5形成CFU-GEMM明顯高于其他各組,P0.05(見表5和附圖13)。圖13A-D是集落形成過程中形成的不同集落,其中圖13A是CFU-GEMM,可見在中心一簇紅細(xì)胞的周圍圍繞著粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,中心團(tuán)簇由于含有較多血紅蛋白化有核紅細(xì)胞,中心區(qū)域呈現(xiàn)紅色。圖13B由多個(gè)BFU-E組成,同時(shí)也因?yàn)閳F(tuán)簇中較高的血紅蛋白化,團(tuán)簇多呈紅色。圖13C是一簇CFU-GM,細(xì)胞密集的中心團(tuán)簇周圍散在一些細(xì)胞,里面包含了粒細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞。和粒細(xì)胞相比,單核細(xì)胞/巨核細(xì)胞更大也形態(tài)上更不規(guī)則。圖13D是CFU-E(×10)。6.流式細(xì)胞檢測對(duì)第1組和第5組形成的小骨進(jìn)行流式細(xì)胞分析,并和小鼠骨髓進(jìn)行對(duì)照,比較發(fā)現(xiàn):group5 vs group1:12.6%vs 0.23%,P0.01;group5 vs FBM:12.6%±0.94%vs10.2%±1.21%,P0.05(附圖14)。結(jié)論:1.多種生物制劑修飾PCL支架可以誘導(dǎo)異位骨/骨髓形成,新型異位骨髓具有類真實(shí)骨髓的造血功能。2.在PCL支架上rh BMP-2、HA、matrigel基質(zhì)膠和SR1組合可形成更接近小鼠脊柱骨密度的骨質(zhì)同時(shí)具有較高造血功能的類真實(shí)骨髓的人工骨髓模型。3.在結(jié)腸癌細(xì)胞中對(duì)41種萘醌類新合成的萘醌類化合物進(jìn)行篩選得到具有低細(xì)胞毒性和在Wnt/β-Catenin通路上較高抑制作用的抑制劑N27,該化合物在構(gòu)建人工骨髓模型中有明顯抑制骨/骨髓形成的作用。4.淫羊藿苷與其他生物制劑組合在PCL支架上形成的骨/骨髓結(jié)構(gòu)和功能僅次于SR1與其他制劑組合。5.通過本研究創(chuàng)建的三維人造骨髓模型相比其他研究技術(shù)難度低、操作簡單、重復(fù)性高、易于普及,為進(jìn)一步的臨床和基礎(chǔ)研究提供新途徑,更為研究普及化打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R-332;R318.1
【圖文】：

- 28 -圖2是六種化合物不同濃度在SW480細(xì)胞中對(duì)集落細(xì)胞形成胞中集落形成與六種化合物劑量依賴的抑制曲線。SW480細(xì)胞列藥物的濃度并孵育37°C恒溫箱，7天后進(jìn)行評(píng)估。相對(duì)克隆數(shù)（未添加藥物）}x100%。結(jié)果為三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行重復(fù)，在6孔板圖（B）中展示的是最有潛力的化合物23（上板）和化合物27的直觀照片。這兩個(gè)化合物以劑量依賴方式減少集落細(xì)胞形成制的濃度≥1.25μM。

中（A）代表CoMFA等高線圖，（B）代表19個(gè)候選化合物的疊加圖

ALP AssayrhBMP-2SR1SR1+rhBMP-2ICARIINICARIIN+rhBMP-2N27N27+rhBMP-20.00.51.01.52.02.5FoldhCangeinALPActivityIcariin 為淫羊藿苷，與 SR1+ rhBMP-2 組比較，組，P<0.05。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為 3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果。附圖 7：Micro-CT 影像及小骨直觀圖

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2795084