【摘要】：目的生物素作為人體和其他哺乳動物體內(nèi)羧化酶的輔酶,參與機體糖原異生、氨基酸分解、脂肪酸合成和能量的代謝。還可通過參與組蛋白的生物素化,來參與染色質(zhì)相關蛋白質(zhì)及組蛋白修飾的下游事件,影響胰島素分泌,導致糖尿病、免疫性疾病等。人體和哺乳類動物腸道可合成生物素,因此一般人群很少發(fā)生生物素缺乏。近年來,關于正常孕期婦女可出現(xiàn)邊緣性生物素缺乏的報道越來越多,同時一些特殊人群如長期服用抗驚厥藥物和抗生物素等病人也會出現(xiàn)生物素缺乏。考慮到生物素缺乏的嚴重后果,使得生物素需要量研究及生物素營養(yǎng)狀況評價面臨嚴峻的挑戰(zhàn)。目前國內(nèi)外還缺乏對生物素需要量的研究,包括人體實驗和動物實驗等均未有報道。因此本研究通過參考《中國居民膳食營養(yǎng)素參考攝入量(2013)》中關于營養(yǎng)素平均需要量(EAR)的方法,嘗試進行生物素需要量的動物實驗研究。考慮到評價機體生物素營養(yǎng)狀況指標較多,各項研究結(jié)論存在爭議,通過綜合考慮指標的代表性、穩(wěn)定性以及方法的可行性,本實驗最終選擇3-羥基異物酰基肉堿(3HIA-肉堿)作為評價生物素營養(yǎng)狀況的“金標準”。因此本研究主要從：(1)建立3HIA-肉堿測定方法,通過比較3HIA-肉堿和微生物法測定生物素水平進行相關性分析進行指標驗證；(2)建立生物素缺乏大鼠模型；(3)對生物素缺乏模型補充不同劑量生物素,綜合血糖血脂指標及生物素營養(yǎng)狀況指標,探討生物素需要量；(4)生物素聯(lián)合纖維素缺乏造�；A上,補充膳食纖維,探討膳食來源生物素與腸內(nèi)源生物素的關系。同時,本研究還從模型血生化代謝特點、組織形態(tài)學和基因組學特征,從整體到組織再到分子基因水平全方位深入研究生物素對糖脂代謝的影響以及其作用機制。方法本研究分四個部分進行生物素營養(yǎng)狀況的研究。1生物素營養(yǎng)狀況評價指標3HIA-肉堿測定方法的建立參考國內(nèi)外文獻,應用超高相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)結(jié)合穩(wěn)定同位素標記技術,建立適用于血清基質(zhì)中3HIA-肉堿的方法。實驗對比3種流動相：A相：水,B相：甲醇；A相：0.1%甲酸水,B相：甲醇；A相：0.1%甲酸水,B相：乙腈,和不同流速下3HIA-肉堿標準出峰峰形以及分離度最好的條件。樣品前處理過程中對比了4種固相萃取柱(WCX、PLS、WAX、MCX)的柱效,同時對不同濃度淋洗液、洗脫液進行優(yōu)化。在方法建立后,進行標準曲線、回收率與精密度和定量限等相關方法學驗證。同時微生物法測定血清生物素,并與3HIA-肉堿的測定結(jié)果進行相關性分析,驗證3HIA-肉堿代表生物素營養(yǎng)狀況的適用性。2建立生物素缺乏模型,探討生物素干預量效反應關系2.1生物素缺乏模型的建立70只體重(100±10)g的SD大鼠按照初始體重隨機分為2組,分別為正常對照組(Control)20只、無生物素組(NB)50只。正常對照組給予普通維持飼料,無生物素組給予模型飼料喂養(yǎng)。觀察大鼠飲食、毛發(fā)、體重變化、糞便變化及死亡情況；喂養(yǎng)開始0w、8w、10w分別內(nèi)眥取血進行血清生物素和血漿3HIA-肉堿的測定,在第10w各組選10只處死以進行病理形態(tài)學及基因?qū)W檢測。2.2生物素干預量效反應關系研究在造模成功后重新設立分組,分別設正常對照組(Control)、無生物素對照組(NB)、NB生物素低劑量(NBL)、NB生物素中劑量(NBM)和NB生物素高劑量干預組(NBH)。正常對照組給予普通維持飼料,無生物素對照組給予模型飼料,其余各組用模型飼料a飼喂。喂養(yǎng)期間NBL、NBM、NBH組分別按每日2μg/d、 4μg/d、10μg/d生物素溶液灌胃,正常對照組、無生物素對照組分別給與等量飲用水進行灌胃。灌胃第8周(即總實驗20w)結(jié)束實驗,空腹過夜條件下戊巴比妥鈉麻醉后腹主動脈取血、處死。分離血清測定血糖、胰島素、TC、TG;剝離動物肝臟、腎臟、脾臟和胰腺稱重,進行大體觀察后放入4%甲醛溶液中固定用于病理染色檢測、胰腺組織免疫組化。取肝臟、大腿肌肉樣品迅速置于RNA保存液中4℃保存,隔夜放入-80。C保存,用于進行大鼠全基因組表達譜芯片分析。無菌條件下取大鼠盲腸內(nèi)容物,-20℃保存,用于腸道16S rDNA細菌基因測序。3可溶性膳食纖維對生物素營養(yǎng)狀況的影響選50只SD大鼠按照以上確立的條件造模,喂養(yǎng)12w。在第10w選10只處死以進行病理形態(tài)學及基因?qū)W檢測。12w后重新設無生物素無纖維素對照組(NBD)、NBD生物素干預組(NBDB)、NBD抗性糊精干預組(NBDF)和NBD生物素聯(lián)合抗性糊精干預組(NBDBF)。另選正常對照組(Control)10只、無生物素對照組(NB)10只。正常對照組給予普通維持飼料,NB組給予模型飼料喂養(yǎng)、NBD組給予模型飼料b,其余各組給予模型飼料c喂養(yǎng)。喂養(yǎng)期間NBDB、NBDF、 NBDBF分別按照每日4gg/d生物素溶液、1g/d抗性糊精溶液、4μg/d生物素溶液+lg/d抗性糊精溶液灌胃,正常對照組、NB對照組、NBD對照組分別給與等量飲用水進行灌胃。其余操作同生物素干預組。4雌鼠受精后生物素缺乏對胎鼠發(fā)育狀況的觀測實驗本研究為預實驗。10只健康雌性大鼠分別與健康、性成熟的雄性大鼠進行交配受孕后,隨機分為正常組和缺乏組。正常組4只孕鼠給予正常飼料,缺乏模型組6只孕鼠給予模型飼料a。同時,4只生物素缺乏雌鼠在相同條件下與健康、性成熟的雄性大鼠進行交配。按照《GB 15193.25-2014食品安全國家標準生殖發(fā)育毒性試驗》對三組雌性大鼠進行生殖發(fā)育毒性試驗操作。結(jié)果1.取大鼠血漿100μl加入25μl 200μg/L的3HIA-肉堿同位素內(nèi)標,用1%甲酸水定容至2ml,充分振蕩40s后,過MCX固相萃取柱(用3ml甲醇和3ml超純水活化)。采用20%甲醇水2ml進行淋洗,3ml 5%氨水甲醇溶液洗脫,40℃條件下N2吹干,后加入lml 5%甲醇水復溶,振蕩混勻過膜。在液相條件：流動相A為0.1%甲酸水溶液,流動相B為甲醇；梯度洗脫：0～2min: 5%～10% B；2.0～6.0min: 10%～100% B；6.0～7.Omin:100%～5% B；進樣量：10μl；流速：250μl·min-1下進樣,利用電噴霧正離子化模式(ESI-),多反應監(jiān)測方式采集3HIA-肉堿及其內(nèi)標指數(shù),進行定量定性研究。血漿中3HIA-肉堿在0.1-20gg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關系,r=0.9995。3水平加標回收率99.6%,RSD為4.8%(n=6)；檢出限為0.04μg/L,定量限為0.1μg/L。測定血清生物素和血漿3HIA-肉堿呈負相關關系,Y=139.67-0.10976.x；相關系數(shù)r=0.79,有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2.給予模型飼料喂養(yǎng)6w后,NB組個別大鼠下頜部開始出現(xiàn)脫毛、活動減少等癥狀,體重和進食量低于正常對照組。干預第8w,脫毛現(xiàn)象顯著。無生物素干預2d后NB組大鼠血清生物素含量明顯降低(P0.05)；血漿3HIA-肉堿含量無明顯差異。干預第8w,NB組血清生物素含量顯著降低,3HIA-肉堿含量明顯升高(P0.05)。補充生物素后,各生物素劑量干預組大鼠進食量和體重增重明顯增加。干預8w后缺乏大鼠毛發(fā)與正常組一致,活動恢復正常。與NB組相比,各劑量生物素干預組血漿3HIA-肉堿含量明顯降低,血清生物素含量明顯升高(P0.05),且各劑量生物素干預組血清生物素含量較高,顯示一定的劑量關系。干預前,NB組大鼠血糖值和血胰島素值低于正常對照組(P0.05)；ALT含量明顯高(P0.05),AST含量有升高趨勢；BUN和CRE的含量高(P0.05)。生物素干預8w后,各干預組大鼠血糖值明顯升高(P0.05),NBL組血糖值恢復至正常對照組水平；LDL下降(P0.05);ALT含量與BUN含量組間差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。說明低劑量生物素(2μg/d)即可維持血糖至正常水平,結(jié)合生物素營養(yǎng)狀況指標變化情況,認為大鼠生物素需要量為2μg/d。同時結(jié)果顯示生物素缺乏造成的肝功和腎功能損傷是不可逆的。大鼠全基因表達譜分析顯示,正常大鼠和生物素缺乏大鼠在Fatty aciddegradation、PPAR signaling pathway、Fatty acid metabolism、Arachidonic acid metabolism和Biosynthesis of unsaturated fatty acids通路上差異最大。3.在無生物素基礎上缺乏纖維素,大鼠毛發(fā)粗糙、下頜部及四肢脫毛現(xiàn)象嚴重。與NB組大鼠相比,NBD組大鼠血清生物素差異無統(tǒng)計學(P0.05)；血漿3HIA-肉堿含量明顯升高(P0.05),血糖值和血胰島素降低(P0.05)。抗性糊精干預8w后,NBDF組大鼠脫毛現(xiàn)象嚴重,攝食量和體重增重下降。NBDB組和NBDBF組大鼠干預4w后,兩組大鼠下頜處和四肢開始長出新毛,干預6w后毛發(fā)與正常大鼠基本一致。與NBD相比,NBDF血清生物素持續(xù)下降,血漿3HIA-肉堿含量持續(xù)升高(P0.05),血糖值存在升高的趨勢(P0.05),血胰島素值降低(P0.05),各項肝功和腎功指標下降趨勢明顯。與NBD組相比,NBDB、NBDBF組血清生物素升高,血漿3HIA-肉堿含量明顯降低(P0.05)；血胰島素含量明顯高(P0.05),LDL含量降低(P0.05)；AST和BUN含量降低(P0.05)。分析抗性糊精和生物素之間無交互作用(P0.05)。以上結(jié)果說明,缺乏纖維素可加重生物素缺乏癥狀；補充抗性糊精后,體內(nèi)腸道菌群產(chǎn)生物素作用不明顯。4.模型對照組(MC)組和模型組雌鼠見栓率同為100%,但是受孕率分別為100%和50%。模型組孕鼠增重明顯低于MC組(P0.05)。MC組吸收胎率為10.64%,模型組達100%,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。與正常組胎鼠相比,MC組胎鼠胸骨發(fā)育不全率和脊髓空腔率明顯較高(P0.05)。與MC孕鼠相比,模型組孕鼠血清催乳素(PRL)、孕酮(P)和黃體生成素(LH)含量較低,雌二醇(E2)含量較高(P0.05)。與正常對照組相比,模型對照組孕鼠PRL、E2含量降低,P、卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素含量升高趨勢明顯(P0.05)。與正常對照組和MC組相比,模型組孕鼠血清生物素最低(P0.05),血漿3HIA-肉堿含量最高(P0.05),而MC組孕鼠血漿3HIA-肉堿略高于正常對照組。實驗表明孕前生物素缺乏可能導致吸收胎甚至不孕；孕后生物素缺乏可能使胎鼠畸形率增高。結(jié)論1.本實驗通過利用UPLC-MS/MS測定技術建立了評價生物素營養(yǎng)狀況的有效指標3HIA-肉堿的測定方法,通過使用3HIA-肉堿同位素內(nèi)標和質(zhì)譜離子定性和定量分析,測定結(jié)果穩(wěn)定。同時本實驗還利用微生物法測定了血清生物素含量,并與3HIA-肉堿進行線性相關分析,發(fā)現(xiàn)二者之間存在負相關關系。提示3HIA-肉堿可用于反映機體生物素營養(yǎng)狀況。2.通過飼喂模型飼料10w,綜合血清生物素和血漿3HIA-肉堿及血糖血脂指標,均證明本研究生物素缺乏大鼠模型誘導成功。3.在無生物素飼料干預2d、8w時,雌鼠血清生物素下降幅度及3HIA-肉堿升高程度均低于雄鼠,此結(jié)果提示雌鼠體內(nèi)是否存在一定的自我保護機制使其免于生物素缺乏危害,值得進一步研究。4.大鼠全基因組表達譜芯片分析顯示生物素對大鼠脂肪酸合成、代謝相關基因表達的影響最顯著。本研究將在Fatty acid degradation、PPAR signaling pathway、 Fatty acid metabolism、Arachidonic acid metabolism和Biosynthesis of unsaturated fatty acids等通路中進行進一步驗證研究。5.參照《中國居民膳食營養(yǎng)素參考攝入量(2013)》中關于營養(yǎng)素平均需要量(EAR)的方法,由本研究動物實驗結(jié)果初步推導人體生物素需要量為20μg/d。6.造模階段纖維素缺乏可加重大鼠生物素缺乏狀況,但單獨補充可溶性膳食纖維(抗性糊精)未見對生物素營養(yǎng)狀況有改善作用。本研究雖未見抗性糊精促進腸道菌群生成內(nèi)源性生物素,但其他類型膳食纖維是否具有相似影響還需要進一步研究。7.初步預實驗結(jié)果表明,生物素缺乏可能導致大鼠吸收胎甚至不孕。
【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R151.42

【參考文獻】

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本文編號：2793210