【摘要】：第一部分人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定 目的：建立穩(wěn)定、高效的體外分離培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（HUC-MSCs）的方法，為采用HUC-MSCs治療急性肺損傷模型做前期準(zhǔn)備。 方法：貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)HUC-MSCs。手術(shù)臺(tái)取正常足月健康嬰兒臍帶組織，剪去兩端結(jié)扎絲線，無(wú)菌條件下D-Hanks緩沖液洗滌殘留血液，剖開臍帶，去除靜脈、動(dòng)脈、外膜，并將其剪碎至1mm×1mm大小組織塊，均勻接種于75cm2培養(yǎng)瓶中，加入完全培養(yǎng)基5ml，倒置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)4h后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)培養(yǎng)瓶，24h后添加培養(yǎng)基至12ml。每3d半量換液一次，去除未貼壁組織塊。待細(xì)胞80%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化，按照2：1比例進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)P3代細(xì)胞表面標(biāo)記物CD34、CD45、HLA-DR、CD73、CD90及CD105表達(dá)。同時(shí)利用成骨、成脂及成軟骨條件培養(yǎng)誘導(dǎo)分化第3代細(xì)胞，在7天后分別觀測(cè)細(xì)胞的成骨、成脂及成軟骨分化能力。成骨誘導(dǎo)第20d后，茜素紅染色鑒定HUC-MSCs成骨分化潛能。成脂誘導(dǎo)15d后，油紅O染色鑒定HUC-MSCs成脂分化能力，成軟骨組織形成后進(jìn)行阿新藍(lán)染色鑒定成軟骨分化能力。 結(jié)果：原代培養(yǎng)的細(xì)胞約24h內(nèi)貼壁生長(zhǎng)，培養(yǎng)96h后在倒置顯微鏡下觀察可見臍帶組織碎塊周圍出現(xiàn)三角形和成纖維樣貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)12d后，細(xì)胞融合度達(dá)到80-90%，細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣漩渦式生長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代10次，細(xì)胞變?yōu)樾螒B(tài)更為均一的成纖維樣，細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變、無(wú)衰老。流式細(xì)胞儀檢測(cè)HUC-MSCs細(xì)胞表面抗原CD34，CD45，CD73，CD90，CD105，HLA-DR表達(dá)率分別是0.19，0.19，99.96，99.10，99.42，0.10,符合HUC-MSCs細(xì)胞表面標(biāo)志物特點(diǎn)。成骨誘導(dǎo)：誘導(dǎo)第10d可觀察到細(xì)胞上方有懸浮的白色鈣結(jié)節(jié)，第20d茜素紅染色可見白色鈣結(jié)節(jié)呈鐵銹紅染色。成脂誘導(dǎo)：誘導(dǎo)第5d觀察到細(xì)胞胞質(zhì)中開始有脂滴形成，第15d油紅O染色可見脂滴紅染。成軟骨誘導(dǎo)：細(xì)胞團(tuán)塊在25d左右會(huì)變得致密，阿新藍(lán)染色后成深藍(lán)色。 結(jié)論：采用貼壁培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法穩(wěn)定、可靠，可以獲得純度較高具有多向分化能力的HUC-MSCs。 第二部分急性肺損傷模型的建立以及人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)其治療作用 目的：建立脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的急性肺損傷（ALI）模型，觀察HUC-MSCs對(duì)ALI模型臨床指標(biāo)的影響，研究HUC-MSCs對(duì)ALI模型的保護(hù)作用。 方法：將BALB/c小鼠分為PBS+PBS（對(duì)照組），PBS+MSCs（干細(xì)胞對(duì)照組），LPS+PBS（模型組），LPS+MSCs（治療組），每組6只老鼠。10%水合氯醛（3ml/kg）腹腔注射麻醉，在麻醉狀態(tài)下行氣管插管術(shù)，PBS+PBS組、PBS+MSCs組和LPS+PBS組、LPS+MSCs組分別給予30μl PBS和30μl LPS（5mg/kg）。1h后PBS+MSCs組和PBS+MSCs組經(jīng)氣管插管給70μl HUC-MSCs懸液（1x106/只），PBS+PBS和LPS+PBS組經(jīng)氣管插管給PBS（70μl/只）。分別在HUC-MSCs給入后第1、3、5d，處死收集肺組織標(biāo)本，觀察肺組織病理改變并進(jìn)行炎癥評(píng)分，計(jì)算肺組織濕/干重比(W/D)。 結(jié)果：經(jīng)氣管插管給予LPS構(gòu)建的ALI模型組，與對(duì)照組比較，HE染色結(jié)果表明炎癥浸潤(rùn)明顯、肺泡間隔增厚、肺出血嚴(yán)重及表現(xiàn)肺組織水腫的W/D的增加，表明ALI構(gòu)建模型成功。HUC-MSCs治療ALI模型改善了小鼠死亡率，緩解其缺氧狀態(tài)，肺組織病理學(xué)觀察可見ALI+MSCs組第3，5d處理組肺泡及支氣管周圍炎癥細(xì)胞明顯減少、肺泡間隔縮小、肺泡間隙出血明顯減輕。肺組織病理評(píng)分評(píng)價(jià)在HUC-MSCs治療ALI模型第3d對(duì)對(duì)肺泡阻塞程度、肺泡間隔厚度、肺水腫程度有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05)。 結(jié)論：經(jīng)氣管給予LPS可以成功構(gòu)建ALI模型，HUC-MSCs可以 減輕ALI小鼠模型肺組織損傷程度，改善水腫對(duì)ALI小鼠模型具有保護(hù)作用。 第三部分人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療急性肺損傷模型的機(jī)制初探 目的：探究HUC-MSCs對(duì)急性肺損傷模型的免疫調(diào)節(jié)作用，明確HUC-MSCs治療急性肺損傷模型的分子機(jī)制。 方法：DAPI標(biāo)記HUC-MSCs，氣管插管給HUC-MSCs后示蹤其在肺組織的分布及轉(zhuǎn)移。將BALB/c小鼠分為PBS+PBS組，PBS+MSCs組，LPS+PBS組，LPS+MSCs組，每組6只老鼠。分別在HUC-MSCs給入后第1、2、3d處死小鼠收集BALF標(biāo)本。對(duì)肺泡灌洗液炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類計(jì)數(shù)并測(cè)定BALF中總蛋白含量，檢測(cè)肺組織中髓過(guò)氧化物酶MPO活性。蛋白芯片檢測(cè)LPS+PBS組與LPS+MSC組BALF中308種蛋白表達(dá)。篩選表達(dá)有差異蛋白并用ELISA方法驗(yàn)證BALF中炎癥因子的表達(dá)。 結(jié)果：DAPI可以高效率的標(biāo)記HUC-MSCs，氣管插管5h后HUC-MSCs可在肺組織中均勻分布，24h后逐漸減少。LPS+MSC組與LPS+PBS組相比BALF中細(xì)胞總數(shù)降低，中性粒細(xì)胞比例下降，MPO含量減少，蛋白芯片結(jié)果顯示INF-γ、TLR4、MCP-1、GM-CSF、IL-6、TNF-α、IL-1β明顯降低，VEGF有所增高，ELISA檢測(cè)BALF中IL-6、IFN-γ因子減少。 結(jié)論：HUC-MSCs在肺組織24h后開始減少，對(duì)ALI模型的治療作用主要通過(guò)其龐分泌作用，分泌炎癥因子，影響炎癥細(xì)胞發(fā)揮作用。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R329
【圖文】：

鏡下采集圖像。1.2.6 統(tǒng)計(jì)方法運(yùn)用 SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±s）表示，兩組之間均數(shù)比較采用 t 檢驗(yàn)；以 P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)原代培養(yǎng)細(xì)胞約 24 h 內(nèi)貼壁生長(zhǎng)，培養(yǎng) 96 h 后在倒置顯微鏡下觀察可見臍帶組織碎塊周圍有三角形和成纖維樣貼壁細(xì)胞出現(xiàn)，培養(yǎng) 12 d 后，細(xì)胞融合度達(dá)到80-90%，細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣漩渦式生長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代 10 次，細(xì)胞變?yōu)樾螒B(tài)更為均一的成纖維樣細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變、無(wú)衰老。

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文-MSCs 的增殖能力3 代和 P10 代 HUC-MSCs MTT 增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制細(xì)胞 P3 代和 P10 代 HUC-MSCs 增殖速度較快，2d 后進(jìn)入對(duì)數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)平臺(tái)期，細(xì)胞生長(zhǎng)停滯。兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意C-MSCs 10 代以內(nèi)的連續(xù)傳代不會(huì)影響細(xì)胞增殖能力。

圖 1-3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) hUC-MSCs 細(xì)胞表面標(biāo)志物Fig.1-3 Flow cytometry was used to detect cell the surface marker of HUC-MA CD34 B CD45 C CD73 D CD90 E CD105 F HLA-DRDF B

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 金發(fā)光;;急性肺損傷的診治研究現(xiàn)狀及進(jìn)展[J];中華肺部疾病雜志(電子版);2013年01期

本文編號(hào)：2775616