發(fā)布時間：2020-07-06 23:36

【摘要】：目的:研究血管生成素-2(Angiopoietin-2)在下肢缺血模型的實驗小鼠中,對缺血部位血管生成的作用機制。方法:1.建立C57/B L6小鼠下肢缺血模型及腹腔給藥:麻醉實驗小鼠后,經股深動脈下緣和乆動脈上緣結扎實驗小鼠左側股動脈干支,并且離斷雙結之間股動脈干支,縫合皮膚,復溫后,應用激光多普勒儀記錄實驗小鼠雙下肢血流灌注情況,在結扎前(pre),1d,3d,5d,8d,各記錄一次血流情況。計算左腿與右腿的血流比值,即結扎側與非結扎側的比值。將實驗小鼠分為兩組,對照組和給藥組,各組為3只實驗小鼠,對照組經腹腔注射給予等量的生理鹽水,給藥組腹腔注射重組人血管生成素-2(recombination-human-Ang-2),在結扎日(1d),3d,5d,各給藥一次。在第8d處死實驗小鼠,經下腔靜脈取抗凝血,離心,取上清液;取雙側下肢肌肉,包括內收肌和腓腸肌。2.ELISA法檢測血清中rh-Ang-2的含量:取實驗小鼠離心后的血清,按ELISA試劑盒操作說明檢測血清中rh-Ang-2的含量。3.實時熒光定量PCR分析待測組織樣品中目的基因的表達:用液氮研磨實驗小鼠肌肉組織,用t rizol裂解研碎的組織,傳統(tǒng)法抽提總RNA,瓊脂糖凝膠電泳分析所提RNA質量,逆轉錄合成cDNA,實時熒光定量PCR儀分析目的基因的表達,包括Ang-1,Ang-2,PDGF-BB,PDGFR-β,VEGF-A,VEGF-C。4.應用免疫熒光法分析小鼠肌肉血管生成情況:取小鼠下肢肌肉,以4%多聚甲醛固定,送病理科以石蠟包埋,并制成病理切片,用anti-α-sma做免疫熒光分析,靶向標記血管周細胞,計算新生血管的平均管徑。5.體外血管平滑肌細胞培養(yǎng)研究ang-2對pdgf-bb信號通路的影響:用培養(yǎng)皿培養(yǎng)人臍靜脈血管平滑肌細胞(huvsmc),設置4各組,分別為空白組(control),ang-2組,pdgf-bb組,ang-2+pdgf-bb組,在無血清培養(yǎng)基情況下,在各組中加入對應處理因素,分別做了細胞劃痕實驗和蛋白質印跡實驗。6.統(tǒng)計方法:采用spss17.0軟件進行單因素方差分析,p0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。結果:1.ang-2對下肢缺血小鼠模型血流灌注恢復情況的影響:對照組實驗小鼠內收肌血流自結扎日起,血流逐漸增大,而ang-2組血流增加不明顯;而相比腓腸肌血流變化,對照組與ang-2組無明顯差異。2.血清elisa結果顯示,對照組血清rh-ang-2未檢出,ang-2組血清中檢出rh-ang-2。3.實時熒光定量pcr結果顯示,ang-2組實驗小鼠缺血測內收肌中,促血管生長因子ang-1,ang-2,pdgf-bb,vegf-a,vegf-c的表達量下降。4.免疫熒光顯示ang-2組實驗小鼠下肢缺血測內收肌平均血管管徑小于對照組。5.細胞劃痕實驗顯示,pdgf-bb組劃痕距離恢復最快,ang-2+pdgf-bb次之,ang-2最慢,ang-2阻止pdgf-bb誘導的血管平滑肌細胞遷移;蛋白質印跡實驗顯示,ang-2+pdgf-bb組中pdgfr-β受體的磷酸化被抑制,表明ang-2阻止pdgf-bb增加的pdgfr-β受體的磷酸化。結論:1.ang-2減少下肢缺血灌注,抑制內收肌血管的生成與成熟,對腓腸肌血管新生的影響不明顯。2.rh-Ang-2不存在于對照組小鼠中,而存在于給藥組實驗小鼠血清中,并影響其血管生成。3.Ang-2下調了內收肌血管生成中促血管因子Ang-1,Ang-2,PDGF-BB,VEGF-A,VEGF-C的表達。4.Ang-2抑制缺血測內收肌平均血管管徑的增大。5.Ang-2減弱或者抑制了P DGF-BB/PDGFR-β信號通路。
【學位授予單位】：四川醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R965
【圖文】：

圖 2. Ang-2 減少小鼠下肢血流灌注：在一周時間內，C57/BL6 小鼠下肢缺血模型，激光多普勒掃描顯示 Ang-2 減少小鼠內收肌肉血流灌注，但對腓腸肌影響不大。A，代表性的小鼠內收肌血流變化圖。B,小鼠內收肌血流恢復比較，*P<0.05，n=3/組。C，代表性的小鼠腓腸肌血流變化圖。D，小鼠腓腸肌血流恢復比較。Fig2. Ang-2 reduces blood flow perfusion in a mouse hindlimb ischemia model. in a week time, Ang - 2 reduces blood flow perfusion inischemic adduction muscles, but not gastrocnemius muscles followed Color Laser Doppler Scanner. A . Representative images ofadductor muscle blood flow changes in mice. B. The curve of blood flow recovery of ischemic adductor muscles, * P < 0.05 Vs. vehicle,n=3/group. C. Representative images of the gastrocnemius muscle in mice blood flow changes. D. The curve of blood flow recovery ofischemic gastrocnemius muscles.2. 血清 ELISA 結果按照 human-Ang-2 ELISA 試劑盒的操作說明，檢測兩組小鼠血漿中 rh-Ang-2 的含量。其中，對照組未檢測出 rh-Ang-2，Ang-2組 3 個小鼠均檢測出 rh-Ang-2，其含量分別為 89.908pg/ml，

四川醫(yī)科大學碩士學位論文 3. 實時熒光定量 PCR 擴增效果及分析目的基因 Ang-1，Ang-2，Tie2，VEGF-A，VEGF-C，PDGF-B 和參基因 GAPDH 的擴增曲線表明，目的產物均得到了充分的擴增。在實驗研究中，目的基因 Ang-1，Ang-2，Tie2，VEGF-A，VEGF-C，PDGF和內參基因 GAPDH 的溶解曲線和擴增曲線均符合實驗要求（見圖 到圖 9B）。

四川醫(yī)科大學碩士學位論文 3. 實時熒光定量 PCR 擴增效果及分析目的基因 Ang-1，Ang-2，Tie2，VEGF-A，VEGF-C，PDGF-B 和參基因 GAPDH 的擴增曲線表明，目的產物均得到了充分的擴增。在實驗研究中，目的基因 Ang-1，Ang-2，Tie2，VEGF-A，VEGF-C，PDGF和內參基因 GAPDH 的溶解曲線和擴增曲線均符合實驗要求（見圖 到圖 9B）。

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