發(fā)布時(shí)間：2020-07-01 07:51

【摘要】：研究目的癲癇是一種多病因的腦功能障礙綜合征,以群體神經(jīng)細(xì)胞反復(fù)自發(fā)的異常同步放電為特征。隨著近些年鈣成像技術(shù)的不斷發(fā)展,基于鈣超載假說的癲癇基礎(chǔ)研究也越來越多。本文以癲癇發(fā)生的鈣超載假說為依據(jù),利用光纖光度測(cè)定方法(Fiber photometry),記錄由4-AP(4-aminopyriding)或KA(Kainic acid)給藥誘導(dǎo)自由活動(dòng)小鼠出現(xiàn)的癲癇樣鈣信號(hào),分析癲癇樣鈣信號(hào)與行為學(xué)發(fā)作之間的相關(guān)性,并研究局部光解抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA的光敏復(fù)合物(Rubi-GABA)對(duì)行為學(xué)發(fā)作及與發(fā)作相關(guān)的癲癇樣鈣信號(hào)的影響。研究?jī)?nèi)容1.初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層4-AP局部給藥誘發(fā)的癲癇樣鈣信號(hào)記錄及特征分析,異常鈣信號(hào)與行為學(xué)發(fā)作之間相關(guān)性的研究;2.研究在海馬CA1局部光解GABA籠狀復(fù)合物Rubi-GABA對(duì)KA誘導(dǎo)的急性癇樣發(fā)作和癲癇樣鈣信號(hào)鈣信號(hào)的影響。研究方法1.實(shí)驗(yàn)對(duì)象和分組:選擇2月齡的雄性C57BL/6小鼠為研究對(duì)象;對(duì)于4-AP局部誘發(fā)部分,實(shí)驗(yàn)分為ACSF組、1m M 4-AP和10m M 4-AP組;對(duì)于光解籠鎖Rubi-GABA抑制發(fā)作實(shí)驗(yàn)部分,實(shí)驗(yàn)分為KA組、KA+Saline組和KA+Rubi-GABA組;2.急性癲癇樣發(fā)作的誘導(dǎo)方法與行為學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):1)局部誘發(fā):在小鼠的初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層(Primary motor cortex,M1)局部滴加1m M或10m M的4-AP溶液;2)全身系統(tǒng)給藥:皮下注射20mg/kg劑量的KA溶液。錄制小鼠在給藥前后的行為學(xué)視頻,按照改進(jìn)的瑞辛法則對(duì)小鼠行為進(jìn)行評(píng)分,III級(jí)至V級(jí)的發(fā)作稱為驚厥性運(yùn)動(dòng)發(fā)作(Convulsive motor seizure,CMS);3.鈣信號(hào)記錄:對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行開顱手術(shù)后,通過多細(xì)胞大劑量注射(Multicell bolus loading,MCBL)方法在目標(biāo)腦區(qū)M1、CA1和EC(Entorhinal cortec,EC)加載鈣離子指示劑(Oregon green BAPTA-1 AM,OGB-1 AM),并植入光纖收集熒光信號(hào);4.光解Rubi-GABA:對(duì)于光解Rubi-GABA實(shí)驗(yàn)部分,提前給小鼠CA1預(yù)埋用于藥物注射和光纖埋置的導(dǎo)管,搭建用于光解Rubi-GABA的光纖耦合光路,調(diào)節(jié)光纖端面的輸出功率為10m W;5.鈣信號(hào)分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法:利用基于Lab VIEW編寫的鈣信號(hào)分析軟件讀取和分析實(shí)驗(yàn)所得的鈣信號(hào),其幅值用△F/F表示。對(duì)4-AP或KA給藥前后的鈣信號(hào)進(jìn)行配對(duì)樣本的非參數(shù)t檢驗(yàn);對(duì)其他組進(jìn)行單因素方差檢驗(yàn)。研究結(jié)果1.4-AP局部給藥誘發(fā)的癲癇樣鈣信號(hào):a)與麻醉狀態(tài)下節(jié)律性的自發(fā)鈣活動(dòng)相比,4-AP局部給藥會(huì)誘發(fā)M1出現(xiàn)異常的鈣波,對(duì)照組、1m M 4-AP組和10m M 4-AP組特征鈣信號(hào)的幅度統(tǒng)計(jì)值分別為2.87±0.08%、3.93±0.22%和10.02±0.62%;b)與清醒條件下的自發(fā)鈣活動(dòng)相比,4-AP會(huì)誘導(dǎo)M1出現(xiàn)異常的鈣波,伴隨高頻震蕩,對(duì)照組、1m M 4-AP組和10m M 4-AP組特征鈣信號(hào)的幅度統(tǒng)計(jì)值分別為2.82±0.24%、4.18±0.38%和6.77±0.47%。2.局部光解籠Rubi-GABA對(duì)癇樣發(fā)作的抑制作用:a)KA全身給藥(20mg/kg,s.c.)會(huì)誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)急性癲癇樣發(fā)作,海馬CA1的鈣信號(hào)表現(xiàn)為三種類型:KA-I型鈣波(KA-wave1)、KA-II型鈣波(KA-wave2)和KA-低頻脈沖鈣活動(dòng)(KA-slow flash)。b)在海馬CA1局部光解Rubi-GABA可以緩解KA誘發(fā)的急性癲癇樣發(fā)作,包括發(fā)作等級(jí)由V變成II級(jí),癲癇樣鈣信號(hào)頻率變低。結(jié)論1.4-AP局部注射會(huì)誘發(fā)M1出現(xiàn)與自發(fā)活動(dòng)具有顯著差異的癲癇樣鈣活動(dòng),4-AP濃度越高,癲癇樣鈣信號(hào)幅度越大,神經(jīng)細(xì)胞異常興奮的同步性越強(qiáng);2.皮下注射KA可以誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)急性癲癇樣發(fā)作,在行為學(xué)發(fā)作前海馬CA1已經(jīng)形成了異常的癲癇樣鈣活動(dòng),表現(xiàn)為異常同步的伴隨高頻脈沖樣信號(hào)的鈣波;3.小鼠自由活動(dòng)時(shí),在海馬CA1局部光解Rubi-GABA可以改善KA誘導(dǎo)的急性癇樣發(fā)作和癲癇樣鈣活動(dòng)。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R742.1
【圖文】：

精度電子天平稱取 1.88mg 的 4-AP 粉末（A78403，Sigma），中，充分混勻，配置 4-AP 濃度為 20mM，隨后分裝在 0.2ml℃保存。工作濃度分別為 1mM 和 10mM。驗(yàn)原理鈣信號(hào)采集的光纖光度測(cè)定技術(shù)M-02M FiberOptoMeter 設(shè)備是蘇州國科醫(yī)療委托德國 npi Elect的一款可同時(shí)用于光刺激和熒光測(cè)量的工具。FOM-02M 模塊現(xiàn)兩種不同波長(zhǎng)的光刺激，同時(shí)可以利用同一根光纖進(jìn)行熒電倍增管將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)。光纖通過 FC/PC 連接頭連中的FIBER OUT輸出端口。本研究中使用神經(jīng)元Ca2+信號(hào)記錄2.3A所示。Ca2+指示劑OGB-1AM在波長(zhǎng)488nm處被固態(tài)激光熒光。光纖尖端的光強(qiáng)約為 20~30μ 。該記錄系統(tǒng)使用基于 自定義軟件（National Instruments，Austin，TX，USA）對(duì)激采集進(jìn)行管理。

2+信號(hào)記錄的部分，原理如圖2.3A所示。Ca2+指示劑OGB-1AM在波長(zhǎng)488nm處被固態(tài)激光器激發(fā)，發(fā)出綠色熒光。光纖尖端的光強(qiáng)約為 20~30μ 。該記錄系統(tǒng)使用基于 LabVIEW平臺(tái)上的自定義軟件（National Instruments，Austin，TX，USA）對(duì)激光開/關(guān)控制和數(shù)據(jù)采集進(jìn)行管理。圖 2.2 FOM-02M 模塊前面板（引自 FOM-02M 用戶指南中文版）

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 喬志宏;基于光纖光度測(cè)定法研究癇樣鈣活動(dòng)與光解Rubi-GABA抑制發(fā)作[D];天津醫(yī)科大學(xué);2018年

本文編號(hào)：2736490