【摘要】：研究目的癲癇是一種多病因的腦功能障礙綜合征,以群體神經(jīng)細胞反復自發(fā)的異常同步放電為特征。隨著近些年鈣成像技術的不斷發(fā)展,基于鈣超載假說的癲癇基礎研究也越來越多。本文以癲癇發(fā)生的鈣超載假說為依據(jù),利用光纖光度測定方法(Fiber photometry),記錄由4-AP(4-aminopyriding)或KA(Kainic acid)給藥誘導自由活動小鼠出現(xiàn)的癲癇樣鈣信號,分析癲癇樣鈣信號與行為學發(fā)作之間的相關性,并研究局部光解抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA的光敏復合物(Rubi-GABA)對行為學發(fā)作及與發(fā)作相關的癲癇樣鈣信號的影響。研究內(nèi)容1.初級運動皮層4-AP局部給藥誘發(fā)的癲癇樣鈣信號記錄及特征分析,異常鈣信號與行為學發(fā)作之間相關性的研究;2.研究在海馬CA1局部光解GABA籠狀復合物Rubi-GABA對KA誘導的急性癇樣發(fā)作和癲癇樣鈣信號鈣信號的影響。研究方法1.實驗對象和分組:選擇2月齡的雄性C57BL/6小鼠為研究對象;對于4-AP局部誘發(fā)部分,實驗分為ACSF組、1m M 4-AP和10m M 4-AP組;對于光解籠鎖Rubi-GABA抑制發(fā)作實驗部分,實驗分為KA組、KA+Saline組和KA+Rubi-GABA組;2.急性癲癇樣發(fā)作的誘導方法與行為學評分標準:1)局部誘發(fā):在小鼠的初級運動皮層(Primary motor cortex,M1)局部滴加1m M或10m M的4-AP溶液;2)全身系統(tǒng)給藥:皮下注射20mg/kg劑量的KA溶液。錄制小鼠在給藥前后的行為學視頻,按照改進的瑞辛法則對小鼠行為進行評分,III級至V級的發(fā)作稱為驚厥性運動發(fā)作(Convulsive motor seizure,CMS);3.鈣信號記錄:對實驗動物行開顱手術后,通過多細胞大劑量注射(Multicell bolus loading,MCBL)方法在目標腦區(qū)M1、CA1和EC(Entorhinal cortec,EC)加載鈣離子指示劑(Oregon green BAPTA-1 AM,OGB-1 AM),并植入光纖收集熒光信號;4.光解Rubi-GABA:對于光解Rubi-GABA實驗部分,提前給小鼠CA1預埋用于藥物注射和光纖埋置的導管,搭建用于光解Rubi-GABA的光纖耦合光路,調(diào)節(jié)光纖端面的輸出功率為10m W;5.鈣信號分析和統(tǒng)計學處理方法:利用基于Lab VIEW編寫的鈣信號分析軟件讀取和分析實驗所得的鈣信號,其幅值用△F/F表示。對4-AP或KA給藥前后的鈣信號進行配對樣本的非參數(shù)t檢驗;對其他組進行單因素方差檢驗。研究結(jié)果1.4-AP局部給藥誘發(fā)的癲癇樣鈣信號:a)與麻醉狀態(tài)下節(jié)律性的自發(fā)鈣活動相比,4-AP局部給藥會誘發(fā)M1出現(xiàn)異常的鈣波,對照組、1m M 4-AP組和10m M 4-AP組特征鈣信號的幅度統(tǒng)計值分別為2.87±0.08%、3.93±0.22%和10.02±0.62%;b)與清醒條件下的自發(fā)鈣活動相比,4-AP會誘導M1出現(xiàn)異常的鈣波,伴隨高頻震蕩,對照組、1m M 4-AP組和10m M 4-AP組特征鈣信號的幅度統(tǒng)計值分別為2.82±0.24%、4.18±0.38%和6.77±0.47%。2.局部光解籠Rubi-GABA對癇樣發(fā)作的抑制作用:a)KA全身給藥(20mg/kg,s.c.)會誘導小鼠出現(xiàn)急性癲癇樣發(fā)作,海馬CA1的鈣信號表現(xiàn)為三種類型:KA-I型鈣波(KA-wave1)、KA-II型鈣波(KA-wave2)和KA-低頻脈沖鈣活動(KA-slow flash)。b)在海馬CA1局部光解Rubi-GABA可以緩解KA誘發(fā)的急性癲癇樣發(fā)作,包括發(fā)作等級由V變成II級,癲癇樣鈣信號頻率變低。結(jié)論1.4-AP局部注射會誘發(fā)M1出現(xiàn)與自發(fā)活動具有顯著差異的癲癇樣鈣活動,4-AP濃度越高,癲癇樣鈣信號幅度越大,神經(jīng)細胞異常興奮的同步性越強;2.皮下注射KA可以誘導小鼠出現(xiàn)急性癲癇樣發(fā)作,在行為學發(fā)作前海馬CA1已經(jīng)形成了異常的癲癇樣鈣活動,表現(xiàn)為異常同步的伴隨高頻脈沖樣信號的鈣波;3.小鼠自由活動時,在海馬CA1局部光解Rubi-GABA可以改善KA誘導的急性癇樣發(fā)作和癲癇樣鈣活動。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R742.1
【圖文】：

精度電子天平稱取 1.88mg 的 4-AP 粉末（A78403，Sigma），中，充分混勻，配置 4-AP 濃度為 20mM，隨后分裝在 0.2ml℃保存。工作濃度分別為 1mM 和 10mM。驗原理鈣信號采集的光纖光度測定技術M-02M FiberOptoMeter 設備是蘇州國科醫(yī)療委托德國 npi Elect的一款可同時用于光刺激和熒光測量的工具。FOM-02M 模塊現(xiàn)兩種不同波長的光刺激，同時可以利用同一根光纖進行熒電倍增管將光信號轉(zhuǎn)換成電信號。光纖通過 FC/PC 連接頭連中的FIBER OUT輸出端口。本研究中使用神經(jīng)元Ca2+信號記錄2.3A所示。Ca2+指示劑OGB-1AM在波長488nm處被固態(tài)激光熒光。光纖尖端的光強約為 20~30μ 。該記錄系統(tǒng)使用基于 自定義軟件（National Instruments，Austin，TX，USA）對激采集進行管理。

2+信號記錄的部分，原理如圖2.3A所示。Ca2+指示劑OGB-1AM在波長488nm處被固態(tài)激光器激發(fā)，發(fā)出綠色熒光。光纖尖端的光強約為 20~30μ 。該記錄系統(tǒng)使用基于 LabVIEW平臺上的自定義軟件（National Instruments，Austin，TX，USA）對激光開/關控制和數(shù)據(jù)采集進行管理。圖 2.2 FOM-02M 模塊前面板（引自 FOM-02M 用戶指南中文版）

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相關碩士學位論文 前1條

1 喬志宏;基于光纖光度測定法研究癇樣鈣活動與光解Rubi-GABA抑制發(fā)作[D];天津醫(yī)科大學;2018年

本文編號：2736490