【摘要】：第一部分UC-MSCs對(duì)ALI模型的治療作用目的：完善UC-MSCs胚胎干性相關(guān)基因檢測(cè)；建立脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的C57BL/6和BALB/C兩種遺傳背景的急性肺損傷(ALI)模型,觀察UC-MSCs對(duì)不同背景小鼠ALI的治療作用,證實(shí)UC-MSCs治療LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷療效具有普遍性。方法：用熒光定量PCR方法檢測(cè)UC-MSCs胚胎干性相關(guān)基因OCT-4、SOX-2、NANOG、SSEA-4的表達(dá)；將C57BL/6小鼠分別隨機(jī)分成3組：Ctrl空白對(duì)照組(PBS+PBS)、ALI組(LPS+PBS)、ALI +UC-MSCs治療組(LPS+UC-MSCs),每組24只；BALB/C小鼠分組和處理方法相同。腹腔麻醉后行氣管插管術(shù),Ctrl組給予30μ1 PBS, ALI組和ALI+UC-MSCs組分別給予30μl LPS(5mg/kg)。1h后ALI+UC-MSCs組給予80μl新鮮制備的UC-MSCs細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)量0.5×106)。Ctrl組和ALI組分別給予PBS(80μl)。觀測(cè)各組小鼠體重和生存率的變化,24h、72h、120h處死老鼠收集標(biāo)本,HE染色檢測(cè)肺組織病理改變,檢測(cè)小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)中細(xì)胞總數(shù)及其分類計(jì)數(shù)、總蛋白濃度和MPO活性。結(jié)果：UC-MSCs中胚胎干性相關(guān)基因SSEA-4表達(dá)量較高,達(dá)到胚胎干細(xì)胞表達(dá)量的1/4,但是UC-MSCs基本不表達(dá)其他胚胎干性相關(guān)基因OCT-4、SOX-2、NANOG。經(jīng)氣管插管術(shù)給予LPS構(gòu)建C57BL/6背景的ALI模型,與Ctrl組相比,病理染色結(jié)果顯示大量炎癥細(xì)胞浸潤、肺出血、肺泡間隔增厚,表明C57BL/6ALI模型構(gòu)建成功。UC-MSCs治療后,C57BL/6ALI和BALB/C ALI兩種小鼠的體重和生存率都明顯提高(p0.05)。UC-MSCs治療C57BL/6 ALI模型24h、72h、120h后,小鼠肺組織炎癥明顯下降,肺病理損傷明顯降低,BALF中細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞分類計(jì)數(shù)、總蛋白濃度和MPO活性明顯減低(p0.05)結(jié)論：胚胎干性相關(guān)基因SSEA-4在維持UC-MSCs干性中具有重要意義。UC-MSCs對(duì)BALB/C和C57BL/6不同遺傳背景的ALI小鼠都有很好的治療效果,證實(shí)了UC-MSCs治療ALI的普遍性,為其臨床研究和治療ALI提供了新的證據(jù)。第二部分UC-MSCs對(duì)ALI模型免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用目的：探究UC-MSCs對(duì)ALI模型體內(nèi)免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用,明確UC-MSCs治療ALI的細(xì)胞分子機(jī)制。方法：用蛋白芯片檢測(cè)UC-MSCs治療后ALI小鼠BALF中308種蛋白表達(dá)量的變化。通過GO-term和KEEG-Pathway分析這些差異性蛋白的生物學(xué)功能,揭示UC-MSCs是否具有調(diào)節(jié)ALI小鼠體內(nèi)免疫反應(yīng)的作用,并篩選與其有關(guān)的具體免疫細(xì)胞。采用熒光定量PCR和ELISA驗(yàn)證蛋白芯片的結(jié)果。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)UC-MSCs治療后ALI小鼠肺泡巨噬細(xì)胞數(shù)量和胞內(nèi)IL-10表達(dá)量的改變；體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)用UC-MSCs干預(yù)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥模型,觀察巨噬細(xì)胞形態(tài)變化以及ELISA檢測(cè)其TNF-α、IL-10表達(dá)變化。結(jié)果：蛋白芯片結(jié)果顯示UC-MSCs治療72h后ALI小鼠BALF中22種蛋白明顯降低和8種明顯升高。GO-term和KEEG-pathway分析發(fā)現(xiàn)這些差異性蛋白的主要的生物學(xué)功能與免疫反應(yīng)相關(guān),其中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、CCL17和CCL22與肺泡巨噬細(xì)胞免疫功能密切相關(guān)。PCR和ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示UC-MSCs治療后,ALI小鼠BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6明顯下降,IL-10、CCL17和CCL22明顯升高(p0.05)。體內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示UC-MSCs治療后ALI小鼠肺泡巨噬細(xì)胞數(shù)量減少,但是其胞內(nèi)IL-10的表達(dá)增加(p0.05)。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示UC-MSCs干預(yù)72h后,經(jīng)LPS刺激的巨噬細(xì)胞觸突的數(shù)量減小,ELISA檢測(cè)TNF-α表達(dá)下降和IL-10表達(dá)升高(p0.05)。結(jié)論：UC-MSCs治療可有效調(diào)節(jié)ALI小鼠體內(nèi)肺泡巨噬細(xì)胞的功能,抑制LPS刺激后肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的同時(shí),促進(jìn)其分泌更多的IL-10,對(duì)后續(xù)UC-MSCs治療作用的深入研究奠定基礎(chǔ)。第三部分UC-MSCs治療ALI模型的旁分泌及分子機(jī)制目的：明確UC-MSCs旁分泌對(duì)ALI模型的治療作用,并探討其具體分子機(jī)制。方法：BABL/C小鼠隨機(jī)分ALI、ALI+CM(UC-MSCs)、ALI+CM (Fibroblast) 3組,每組24只。在LPS建模1h后,ALI+CM(UC-MSCs)組、ALI+CM (Fibroblast)組分別給予80μ1 UC-MSCs和Fibroblast的濃縮條件培養(yǎng)基,ALI組給予80ulPBS,觀察各組小鼠體重、生存率變化,24h、72h、120h處死小鼠收集標(biāo)本,HE染色檢測(cè)肺組織病理變化。ELISA檢測(cè)UC-MSCs與LPS刺激后的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)中UC-MSCs分泌的PGE2、IL-4、IL-13的表達(dá)量。體外實(shí)驗(yàn)用PGE2合成關(guān)鍵酶特異性抑制劑Celecoxib干預(yù)UC-MSCs后收集細(xì)胞及其上清,分別與LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥模型共培養(yǎng)72h,檢測(cè)巨噬細(xì)胞TNF-a和IL-10的表達(dá)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)將小鼠隨機(jī)分為Ctr1、AL、ALI+UC-MSCs、 ALI+UC-MSCs (-PGE2)、ALI+CM、ALI+CM (-PGE2)6組,每組24只。LPS建模1h后ALI+UC-MSCs組和ALI+CM組分別給予未經(jīng)Celecoxib處理的80μl UC-MSCs細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)量0.5x10‘)和濃縮條件培養(yǎng)基,ALI+UC-MSCs(-PGE2)組和ALI+CM (-PGE2)組分別給予80μl經(jīng)Celecoxib處理的UC-MSCs細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)量0.5x106)和濃縮條件培養(yǎng)基,Ctrl、ALI給予80μlPBS。觀察各組體重、生存率變化,在72h處死老鼠收集標(biāo)本,HE染色檢測(cè)肺組織病理改變,ELISA險(xiǎn)測(cè)BALF中TNF-a和IL-10表達(dá)變化。結(jié)果：UC-MSCs的條件培養(yǎng)基能夠有效保護(hù)ALI模型小鼠,與ALI組比較,ALI+CM(UC-MSCs)組小鼠的體重和生存率明顯提高,肺病理損傷明顯降低(p0.05)；體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)UC-MSCs與LPS的刺激巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)72h后,UC-MSCs表達(dá)的PGE2明顯升高(p0.05),而IL-4、IL-13表達(dá)量沒有改變。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)PGE2被Celecoxib干預(yù)后,UC-MSCs及其條件培養(yǎng)基對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用都明顯下降,分別與Mac+LPS+UC-MSCs組和Mac+LPS+CM組比較,Mac+LPS+UC-MSCs(-PGE2)組和Mac+LPS+CM(-PGE2)組中巨噬細(xì)胞TNF-a表達(dá)升高和IL-10表達(dá)降低(p0.05)。體內(nèi)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)PGE2被Celecoxib干預(yù)后,UC-MSCs及其條件培養(yǎng)基對(duì)ALI小鼠的保護(hù)作用都明顯下降,分別與ALI+UC-MSCs組和ALI+CM組相比較,ALI+UC-MSCs(-PGE2)組、ALI+CM (-PGE2)組ALI小鼠的體重和生存率明顯下降,肺組織損傷加重,BALF中細(xì)胞因子TNF-a升高和IL-10下降(p0.05)。結(jié)論：UC-MSCs主要通過旁分泌功能,尤其是分泌PGE2在UC-MSCs治療LPS誘導(dǎo)的ALI動(dòng)物模型中發(fā)揮治療作用,為后續(xù)利用UC-MSCs臨床治療ALI/ARDS提供了新的機(jī)制證據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R725.6;R-332
【圖文】：

２．２邋ＵＣ－ＭＳＣｓ對(duì)ＡＬＩ的治療作用：逡逑２．２．１小鼠一巧情況和生存率的改變逡逑Ｃ５７ＢＵ６ＡＬ１和ＢＡＬＢ／ＣＡＵ小鼠食董都明顯減少，毛發(fā)凌亂，活動(dòng)量少，對(duì)逡逑外界刺激反應(yīng)慢。ＵＣ－ＭＳＣｓ治療后，兩種ＡＵ小鼠的食量增加，體重都明顯上升逡逑（圖１－２），對(duì)外界刺激的敏感度也明顯增加。逡逑

７０Ｈ邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ逡逑０邐２４邐４８邐７２邐９６邐１２０（ｈ）逡逑圖１－３邋ＵＣ－ＭＳＣｓ治療ＡＵ生存率的變化逡逑Ｆｉｇｌ－３邋Ｔｈｅ邋ｓｕｒｖｉｖａｌ邋ｃｈａｎｇｅ邋ｏｆ邋ＡＬＩ邋ｍｉｃｅ邋ｗｉｔｈ邋ＵＣ－ＩＭＳＣｓ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ逡逑＊或者抑＾邋ｐ＜0．0５，＊＊或者＃＃代表ｐ＜０．０１逡逑＊代表邋ＡＬＩ（Ｃ巧ＢＬ化）／ＡＬＩ（Ｃ巧ＢＬ／６）＋ＵＣ－ＭＳＣｓ，抑Ｍｌ邋ＡＬＩ邋（邋ＢＡＢＬ／Ｃ）逡逑／ＡＬＩ（ＢＡＢＬ／Ｃ）＋ＵＣ－ＭＳＣｓ逡逑２７逡逑

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本文編號(hào)：2730228