【摘要】：研究目的癲癇是一種多病因腦功能障礙綜合癥,隨著相關(guān)研究不斷發(fā)展,普遍認(rèn)為癲癇的發(fā)作與群體神經(jīng)細(xì)胞異常的同步放電有關(guān)。本研究基于癲癇發(fā)生的鈣假說,利用多通道光纖光度測定方法(Multi-channel fiber photometry),在腹腔注射海人酸(Kainic acid,KA)誘導(dǎo)自由活動小鼠急性癇樣發(fā)作前后,同步記錄海馬(Hippocampus)CA1區(qū)和初級運動皮層(Primary motor cortex)M1區(qū)出現(xiàn)的鈣信號,分析兩個腦區(qū)的鈣活動特征及其與小鼠行為學(xué)表現(xiàn)的關(guān)聯(lián),并研究在海馬CA1區(qū)局部光解籠抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸(GABA)的光敏復(fù)合物Rubi-GABA,對初級運動皮層M1區(qū)癇樣鈣信號和小鼠行為學(xué)發(fā)作嚴(yán)重程度的影響。研究內(nèi)容1.麻醉狀態(tài)海馬CA1區(qū)和初級運動皮層M1區(qū)鈣信號的同步記錄及特征分析;2.清醒自由活動狀態(tài)和腹腔注射KA誘發(fā)急性癇樣發(fā)作狀態(tài),海馬CA1區(qū)和初級運動皮層M1區(qū)的鈣信號同步記錄及特征分析;3.在海馬CA1區(qū)局部光解籠Rubi-GABA對初級運動皮層M1區(qū)癇樣鈣信號和小鼠行為學(xué)發(fā)作嚴(yán)重程度的影響。研究方法1.實驗對象和分組:選用SPF(Specific pathogen free)級別8~12周的雄性C57BL/6小鼠為研究對象。觀察KA誘發(fā)癇樣發(fā)作部分,實驗分為腹腔注射生理鹽水對照組和腹腔注射10mg/kg劑量KA實驗組;海馬CA1區(qū)局部光解籠Rubi-GABA部分,實驗分為生理鹽水+光照對照組和Rubi-GABA+光照實驗組;2.急性癇樣發(fā)作建模和行為學(xué)評價:腹腔注射10mg/kg劑量KA溶液誘發(fā)急性癇樣發(fā)作。對小鼠給藥前10min和給藥后1.5h的行為學(xué)表現(xiàn)進(jìn)行視頻錄制(與鈣信號同步記錄),按照改進(jìn)的Racine分級法則對小鼠癇樣發(fā)作行為評級,出現(xiàn)Ⅰ級以上發(fā)作則認(rèn)為誘發(fā)發(fā)作成功,將Ⅲ級以上統(tǒng)稱為驚厥性運動發(fā)作(Convulsive motor seizure,CMS);3.鈣信號記錄:實驗小鼠進(jìn)行開顱手術(shù)后在其海馬CA1區(qū)和初級運動皮層M1區(qū)注射加載鈣離子指示劑Cal-520 AM,并在其上方植入記錄光纖收集信號;4.光解籠Rubi-GABA:實驗小鼠進(jìn)行開顱手術(shù)后在其海馬CA1區(qū)注射Rubi-GABA,并在其上方植入光纖用于局部光解籠。參與局部光解籠所需激發(fā)光的耦合光路的搭建,用于光解籠的光纖端面的輸出功率調(diào)整為15m W;5.鈣信號分析與統(tǒng)計:采用基于MATLAB編寫的Op Signal多通道分析軟件對鈣信號進(jìn)行讀取和分析,其中鈣活動的幅值用△F/F表示;用Clampfit 10.6統(tǒng)計鈣活動的幅值、頻率和持續(xù)時間;用Graphpad Prism7進(jìn)行配對樣本的非參數(shù)檢驗。研究結(jié)果1.麻醉和清醒狀態(tài)下同步記錄海馬CA1區(qū)和初級運動皮層M1區(qū)的鈣信號:a)異氟烷/氧氣體積分?jǐn)?shù)為1.2%的條件下,CA1區(qū)鈣信號的幅值為1.54±0.35%△F/F,頻率為0.10±0.005Hz,M1區(qū)鈣信號的幅值為1.76±0.29%△F/F,頻率為0.14±0.03Hz;b)異氟烷/氧氣體積分?jǐn)?shù)為0.8%的條件下,CA1區(qū)鈣信號的幅值為0.78±0.17%△F/F,頻率為0.20±0.02Hz,M1區(qū)鈣信號的幅值為1.16±0.14%△F/F,頻率為0.38±0.04Hz;c)清醒自由活動條件下,CA1區(qū)鈣信號的幅值為0.92±0.20%△F/F,頻率為0.32±0.06Hz;M1區(qū)鈣信號的幅值為1.05±0.17%△F/F,頻率為0.35±0.04Hz。2.急性癇樣發(fā)作狀態(tài)下同步記錄海馬CA1區(qū)和初級運動皮層M1區(qū)的鈣信號:a)海馬CA1區(qū)的鈣信號表現(xiàn)為兩種大類型,一種是基線升高且具有較長持續(xù)時間式鈣波,另一種是基線平穩(wěn)的簇狀高頻脈沖式鈣波。第一種類型的鈣波又分為兩小類,第一種由鈣積聚(build-up)和特征類似于皮層擴(kuò)布抑制(Cortical spreading depression,CSD)的大波組成,這種CSD樣鈣波的幅值最大,為42.64±9.74%△F/F,持續(xù)時間最長,為216.50±26.25s;第二種單獨出現(xiàn)的非CSD樣鈣波的幅值為15.18±3.29%△F/F,持續(xù)時間為70.75±12.47s�；�平穩(wěn)的簇狀高頻脈沖式鈣波的幅值為9.83±2.64%△F/F。b)初級運動皮層M1區(qū)的鈣信號僅表現(xiàn)為基線升高且具有較長持續(xù)時間式鈣波,和海馬CA1區(qū)癇樣鈣信號相似,其中也分為兩個小類,CSD樣鈣波幅值為32.79±4.55%△F/F,持續(xù)時間為333.50±66.65s;非CSD樣鈣波幅值為4.08±0.91%△F/F,持續(xù)時間為92.50±21.75s。3.海馬CA1區(qū)局部光解籠Rubi-GABA對初級運動皮層M1癇樣鈣信號的影響:在初級運動皮層M1區(qū)出現(xiàn)癇樣鈣信號時在海馬CA1區(qū)進(jìn)行持續(xù)時間為30s的光照,觀察到初級運動皮層M1區(qū)癇樣鈣信號“變形”,即明顯幅值上升和出現(xiàn)高頻震蕩脈沖波形,與生理鹽水對照組有明顯區(qū)別,且對鈣波出現(xiàn)伴隨的行為學(xué)發(fā)作有加重效果。結(jié)論1.麻醉狀態(tài)下,海馬CA1區(qū)和初級運動皮層M1區(qū)的鈣信號具有一定的同步性,且其幅值和頻率具有麻醉濃度依賴性,麻醉濃度越大,鈣信號頻率越低,幅值越大。不同麻醉濃度下分別具有統(tǒng)計學(xué)差異。2.腹腔注射KA誘發(fā)急性癇樣發(fā)作狀態(tài)下,海馬CA1區(qū)和初級運動皮層M1區(qū)中,基線抬升且具有一定持續(xù)時長式的鈣波出現(xiàn)時具有一定的同步性,特別是非CSD樣鈣活動;CSD樣鈣活動在兩個腦區(qū)均各自出現(xiàn),且在CA1區(qū)出現(xiàn)的次數(shù)均高于M1;簇狀高頻脈沖式鈣波則僅出現(xiàn)在海馬CA1區(qū)。不同種類的鈣信號的出現(xiàn)與行為學(xué)表現(xiàn)有一定的對應(yīng)關(guān)系。3.在海馬CA1區(qū)局部光解籠Rubi-GABA會出現(xiàn)對初級運動皮層M1區(qū)癇樣鈣活動和行為學(xué)發(fā)作有加重其異常和無效的結(jié)果。
【圖文】：

Adelsberger 等人首次采用了如圖 1 所示的基于光纖的方法，記錄到了非麻醉的新生小鼠大腦皮層神經(jīng)元的自發(fā)反復(fù)的鈣瞬變現(xiàn)象[26,27]。2007 年，Murayama 等人利用基于光纖的設(shè)備結(jié)合 OGB-1AM 記錄到麻醉和自由活動大鼠新皮質(zhì) 5 層錐體神經(jīng)元樹突的鈣活動[27,28]。2010 年，Lütcke 等人記錄到了清醒自由活動小鼠桶狀皮層錐體神經(jīng)元的鈣信號[29]。2012 年，Schulz 等人記錄到了大鼠體感皮層的鈣活動[30]。2013 年，Pashaie 等人發(fā)表了光纖光度檢測技術(shù)的設(shè)計思路，研發(fā)的光纖探頭中的多模光纖是可植入型，在將激發(fā)光傳送到目標(biāo)腦區(qū)的同時將收集到的信號傳送回檢測器[31]。2014 年，Deisseroth 等人命名了光纖光度檢測技術(shù)，同時利用該技術(shù)觀測了神經(jīng)元軸突末端活動和相關(guān)的動物行為；還結(jié)合了光遺傳學(xué)技術(shù)，證明在社交行為中腹側(cè)被蓋區(qū)到伏隔核的神經(jīng)投射起著非常重要的作用[32]。同年 Cui 等人發(fā)表了單光子計數(shù)光纖系統(tǒng)（Time-correctedsingle-photon counting based fiber optics system, TCSPC），能夠?qū)崿F(xiàn)自由活動小鼠深部腦區(qū)熒光指示劑各項參數(shù)的測量[33]。光纖光度檢測技術(shù)快速發(fā)展，并被越來越多地運用于各類生理狀態(tài)或疾病模型的研究中，，包括抑郁癥[34]，自閉癥[35]，癲癇[36]，獎賞等[37]。

圖 2 現(xiàn)有神經(jīng)活動記錄方法比較（引自千奧星科微型顯微成像系統(tǒng)說明書）雙光子熒光顯微鏡鈣成像能在環(huán)路水平記錄單個特定類型神經(jīng)細(xì)胞的功能活動[38]。雙光子顯微鏡與普通顯微鏡相比，優(yōu)點在于光毒性和光漂白作用較小；時間分辨率更高，可以捕捉到鈣動力學(xué)現(xiàn)象；空間分辨率也很好，能夠觀察到亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)[27,39]。其局限性在于實驗動物需要頭部固定，無法觀察更加復(fù)雜的行為學(xué)實驗[40]，如動物社交實驗[27]。且絕大多數(shù)研究只能在大腦的皮層開展，成像深度小，深部腦組織成像，如海馬、杏仁核等，要么幾乎無法實現(xiàn)，要么需要去除目標(biāo)腦區(qū)上方的腦組織，會造成較為嚴(yán)重的損傷[41]。另外，雙光子顯微鏡系統(tǒng)機(jī)構(gòu)龐大，價格昂貴，搭建、發(fā)展、維護(hù)和改進(jìn)都存在很多困難，限制了其應(yīng)用范圍。微型顯微成像技術(shù)利用 GRIN 梯度折射透鏡為植入鏡頭，將其與超小型成像CMOS 芯片結(jié)合，能夠?qū)崟r觀察自由活動動物單細(xì)胞水平神經(jīng)細(xì)胞活動的鈣信號。其優(yōu)點在于系統(tǒng)體積小，重量輕，基本不限制小鼠和其他常用實驗動物（如哺乳類動物）的行為，能夠應(yīng)用的行為范式多樣；還可以提供神經(jīng)環(huán)路水平幾十到幾百個神經(jīng)元的鈣信號，為神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)機(jī)制的研究提供更豐富的信息。但這
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R742.1

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本文編號：2707101