【摘要】：嬰幼兒麻醉手術(shù)安全性的問題始終是社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn),在過去的若干年有大量的臨床研究表明嬰幼兒時(shí)期多次麻醉手術(shù)暴露對(duì)發(fā)育中的大腦有神經(jīng)毒性,影響其遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶能力~([1-3]),然而單次暴露結(jié)論尚不一致~([4])。Tau蛋白是認(rèn)知功能領(lǐng)域研究的經(jīng)典標(biāo)志性蛋白,與神經(jīng)損傷的發(fā)生密切相關(guān)~([5-7])。Tau蛋白異常磷酸化后易從微管脫落,互相纏結(jié)形成不溶性聚合體,是形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)的重要因素~([8-10])。而細(xì)胞外ATP對(duì)神經(jīng)元興奮性、可塑性有調(diào)控作用~([11,12]),本課題以細(xì)胞外ATP與Tau的相互作用為切入點(diǎn),深入研究單次麻醉手術(shù)對(duì)幼年小鼠認(rèn)知功能及神經(jīng)損傷的影響,并探討其分子機(jī)制,為相關(guān)腦保護(hù)提供理論支持。實(shí)驗(yàn)一:七氟烷麻醉加手術(shù)導(dǎo)致幼齡小鼠腦間質(zhì)液中ATP水平增高目的:麻醉加手術(shù)可造成幼年小鼠遠(yuǎn)期認(rèn)知功能障礙,機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)擬探討七氟烷麻醉加手術(shù)對(duì)幼年小鼠(P8)遠(yuǎn)期認(rèn)知功能的改變及腦組織ATP水平的影響。方法:選擇出生8d(P8)的小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn),將52只小鼠隨機(jī)分為2組,對(duì)照組(Control)和七氟烷加手術(shù)組(Sevoflurane+Surgery)。其中七氟烷加手術(shù)組在3%七氟烷+60%O_2條件下行剖腹探查手術(shù),對(duì)照組只給予60%O_2處理。待小鼠生長至第30天,進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試,評(píng)價(jià)兩組小鼠學(xué)習(xí)能力和記憶能力(Control組19只,Sevoflurane+Surgery組15只);七氟烷加手術(shù)處理后即刻,收集小鼠血液標(biāo)本,取小鼠皮層組織(每組3只),應(yīng)用ATP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)小鼠腦皮質(zhì)組織和血液中ATP水平;七氟烷加手術(shù)處理后即刻,提取兩組小鼠線粒體,對(duì)小鼠線粒體呼吸功能進(jìn)行檢測(cè)(每組3只);給出生8d(P8)的小鼠置入微透析套管,分別于麻醉手術(shù)前、單純麻醉狀態(tài)下、和麻醉加腹部手術(shù)狀態(tài)下收集腦間質(zhì)液,測(cè)定腦間質(zhì)液ATP含量(每組3只)。結(jié)果:1.七氟烷麻醉加手術(shù)可導(dǎo)致小鼠水迷宮逃避潛伏期延長,平臺(tái)穿梭次數(shù)減少,致幼年小鼠遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶功能損傷;2.小鼠皮層組織ATP水平在七氟烷麻醉加手術(shù)組輕微升高;3.小鼠血液中ATP水平在兩組間沒有差異;4.兩組小鼠皮層線粒體呼吸功能沒有差異;5.同一只小鼠,單純麻醉不影響腦間質(zhì)液中ATP的水平,但是當(dāng)給予手術(shù)刺激后,小鼠腦間質(zhì)液中ATP水平明顯升高,對(duì)照組小鼠腦間質(zhì)液ATP水平穩(wěn)定,不隨時(shí)間升高。結(jié)論:七氟烷麻醉加手術(shù)可導(dǎo)致幼齡小鼠遠(yuǎn)期認(rèn)知功能障礙,其機(jī)制可能與七氟烷麻醉加手術(shù)所致的腦間質(zhì)液中ATP水平升高有關(guān)。實(shí)驗(yàn)二:細(xì)胞外ATP在七氟烷麻醉加手術(shù)引起的Tau蛋白磷酸化中的關(guān)鍵作用目的:上一部分實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)麻醉加手術(shù)刺激可導(dǎo)致小鼠腦間質(zhì)液ATP水平升高,本研究分別以小鼠、SH-SY5Y細(xì)胞系和原代培養(yǎng)神經(jīng)元為研究對(duì)象,擬證明細(xì)胞外ATP升高可導(dǎo)致Tau蛋白磷酸化,是七氟烷麻醉加手術(shù)引起幼年小鼠遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶能力降低的重要原因。方法:1.選用出生8d(P8)的小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn),共18只,隨機(jī)分為3組,每組6只:對(duì)照組(Control)、ATP組(ATP)和七氟烷加手術(shù)組(Sevoflurane+Surgery)。麻醉手術(shù)后即刻處死小鼠,提取皮層組織,應(yīng)用Western blot檢測(cè)小鼠大腦皮層Tau-PS202/PT205、total Tau(Tau46)的表達(dá);2.體外培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞,分為對(duì)照組(Control)、ATP組(ATP),ATP組培養(yǎng)基中加不同濃度的ATP刺激,應(yīng)用Western blot檢測(cè)細(xì)胞中Tau-PS202/PT205(AT8)、total Tau(Tau46)的表達(dá);3.提取胎鼠神經(jīng)元進(jìn)行體外培養(yǎng),分為對(duì)照組(Control)、ATP組(ATP),ATP組培養(yǎng)基中加不同濃度的ATP刺激,應(yīng)用Western blot檢測(cè)神經(jīng)元細(xì)胞Tau-PS202/PT205(AT8)、total Tau(Tau46)的表達(dá)。結(jié)果:1.P8小鼠腹腔注射ATP和麻醉手術(shù)均能導(dǎo)致小鼠皮質(zhì)Tau-PS202/PT205表達(dá)升高,而total Tau表達(dá)不受影響;2.在SH-SY5Y細(xì)胞中,培養(yǎng)基中ATP濃度高至2μM時(shí),可導(dǎo)致Tau-PS202/PT205表達(dá)明顯升高,total Tau表達(dá)不變;3.在原代培養(yǎng)神經(jīng)元中,培養(yǎng)基中ATP濃度高至1mM時(shí),可導(dǎo)致Tau-PS202/PT205表達(dá)明顯升高,total Tau表達(dá)不變。結(jié)論:細(xì)胞外ATP升高無論在幼鼠、SH-SY5Y細(xì)胞系還是原代培養(yǎng)神經(jīng)元中,均可引起Tau蛋白磷酸化,顯著增加Tau-PS202/PT205表達(dá)水平,說明七氟烷麻醉加手術(shù)引起的腦間質(zhì)液中ATP升高可導(dǎo)致Tau蛋白磷酸化,是引發(fā)幼齡小鼠麻醉手術(shù)后認(rèn)知功能障礙的重要因素。實(shí)驗(yàn)三:CDK5是細(xì)胞外ATP導(dǎo)致Tau蛋白磷酸化的關(guān)鍵激酶目的:Tau蛋白磷酸化有多種激酶,APP、GSK3β、CDK5、MAPK1、MAPK3、JNK、PKA等等多種蛋白在不同條件下可導(dǎo)致Tau蛋白不同位點(diǎn)的磷酸化,可導(dǎo)致Tau-PS202/PT205磷酸化的激酶又有GSK3β、CDK5、PKA、CK1/2等許多種~([13]),為明確在七氟烷麻醉加手術(shù)模型中使Tau-PS202/PT205磷酸化的關(guān)鍵激酶,本實(shí)驗(yàn)通過蛋白質(zhì)譜篩選差異蛋白加Western blot驗(yàn)證的方法尋找麻醉手術(shù)致Tau蛋白磷酸化的關(guān)鍵激酶。方法:1.出生8d(P8)小鼠各18只隨機(jī)分為3組(n=6/組):對(duì)照組(Control)、ATP組(ATP)和七氟烷加手術(shù)組(Sevoflurane+Surgery)。麻醉手術(shù)后即刻處死小鼠,提取皮層組織,進(jìn)行蛋白質(zhì)譜分析,篩選可能的Tau蛋白激酶,應(yīng)用Western blot驗(yàn)證小鼠大腦皮層GSK3β、p-GSK3β-ser9、p-GSK3β-tyr216、CDK5的表達(dá);2.提取胎鼠神經(jīng)元進(jìn)行體外培養(yǎng),分為對(duì)照組(Control)、ATP組(ATP),應(yīng)用Western blot檢測(cè)神經(jīng)元細(xì)胞GSK3β、p-GSK3β-ser9、p-GSK3β-tyr216和CDK5的表達(dá)。結(jié)果:1.蛋白質(zhì)譜分析篩選ATP組小鼠和Sevoflurane+Surgery組小鼠共同升高且大于2倍、與Tau磷酸化相關(guān)的激酶有GSK3β和CDK5;2.與Control組小鼠相比,ATP組和Sevoflurane+Surgery組小鼠皮層中總GSK3β均沒發(fā)生改變,而p-GSK3β-ser9增高,p-GSK3β-tyr216降低,其活性受到了抑制。該結(jié)果表明ATP組和Sevoflurane+Surgery組Tau蛋白的磷酸化是非GSK3β依賴的。而CDK5表達(dá)水平則在ATP組和Sevoflurane+Surgery組均升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明CDK5才是七氟烷麻醉加手術(shù)模型中Tau蛋白磷酸化的關(guān)鍵激酶;3.在原代神經(jīng)元中,與小鼠皮層結(jié)果不同,ATP組GSK3β量與磷酸化水平均與Control組沒有差異,但CDK5水平同樣是在ATP組升高,說明在原代神經(jīng)元中CDK5才是細(xì)胞外ATP導(dǎo)致Tau蛋白磷酸化的關(guān)鍵激酶。結(jié)論:在麻醉加手術(shù)模型中,腦組織細(xì)胞外ATP升高,升高的細(xì)胞外ATP導(dǎo)致Tau蛋白磷酸化是通過CDK5激酶實(shí)現(xiàn)的,這一過程不依賴GSK3β。實(shí)驗(yàn)四:細(xì)胞外ATP作用于GluR2,激活CDK5從而導(dǎo)致Tau蛋白磷酸化目的:Tau蛋白和CDK5蛋白均是位于細(xì)胞內(nèi),細(xì)胞外ATP通過何種途徑作用于細(xì)胞內(nèi)的CDK5導(dǎo)致Tau蛋白磷酸化是該部分實(shí)驗(yàn)的研究目標(biāo)。在質(zhì)譜數(shù)據(jù)中篩選跨膜受體,發(fā)現(xiàn)GluR2表達(dá)顯著增高,GluR2作為一個(gè)四次跨膜蛋白,極有可能是介導(dǎo)細(xì)胞外ATP與細(xì)胞內(nèi)Tau蛋白磷酸化的關(guān)鍵受體。本實(shí)驗(yàn)擬通過使用GluR2特異性抑制劑pep2m抑制GluR2活性來驗(yàn)證在麻醉手術(shù)模型中,GluR2是否為介導(dǎo)細(xì)胞外ATP與細(xì)胞內(nèi)Tau蛋白磷酸化的關(guān)鍵受體。另有49只小鼠分為四組,Control+aCSF組(N=12)、Sevoflurane+Surgery+aCSF組(N=12)及Control+pep2m組(N=10)、Sevoflurane+Surgery+pep2m組(N=13)于小鼠生后8d進(jìn)行七氟烷麻醉加手術(shù)及藥物干預(yù),待小鼠長至30天進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試。方法:出生8d的小鼠36只,用隨機(jī)數(shù)字表將其分為6組,每組6只:對(duì)照組+aCSF注射組(Control+aCSF)、ATP+aCSF組(ATP+aCSF)、七氟烷麻醉加手術(shù)+aCSF組(Sevoflurane+Surgery+aCSF)、對(duì)照組+pep2m組(Control+pep2m)、ATP+pep2m組(ATP+pep2m)、七氟烷麻醉加手術(shù)+pep2m組(Sevoflurane+Surgery+pep2m),應(yīng)用Western blot檢測(cè)神經(jīng)元細(xì)胞CDK5和Tau-PS202/PT205的表達(dá)。結(jié)果:1.蛋白質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)顯示ATP組小鼠和Sevoflurane+Surgery組小鼠GluR2表達(dá)均顯著增高,這一結(jié)果在Western blot中得到了驗(yàn)證;2.與Control組小鼠相比,ATP組和Sevoflurane+Surgery組小鼠皮層中CDK5和Tau-PS202/PT205均增高,GluR2特異性抑制劑pep2m可抑制ATP腹腔注射和麻醉手術(shù)引起的CDK5和Tau-PS202/PT205表達(dá)增高;3.Pep2m可抑制麻醉手術(shù)引起的幼鼠遠(yuǎn)期空間學(xué)習(xí)記憶能力下降。結(jié)論:細(xì)胞外ATP通過與GluR2的相互作用引起CDK5表達(dá)增加和Tau蛋白磷酸化,進(jìn)而引發(fā)學(xué)習(xí)記憶能力下降。小結(jié)1.單次七氟烷麻醉加手術(shù)可造成幼年小鼠遠(yuǎn)期認(rèn)知功能障礙;2.七氟烷麻醉加手術(shù)可引起幼鼠腦間質(zhì)液ATP水平增高,并且這一增高是中樞源性而非外周血來源的;3.細(xì)胞外ATP升高在動(dòng)物和細(xì)胞水平均可導(dǎo)致Tau蛋白磷酸化增加;4.細(xì)胞外ATP升高導(dǎo)致的Tau蛋白磷酸化增加不依賴GSK3β,CDK5才是ATP升高導(dǎo)致的Tau蛋白磷酸化的關(guān)鍵激酶;5.細(xì)胞外ATP通過膜表面受體GluR2來調(diào)控CDK5表達(dá)和Tau蛋白磷酸化進(jìn)而影響學(xué)習(xí)記憶能力。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R726.1

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本文編號(hào)：2676445