發(fā)布時間：2020-05-07 01:32

【摘要】：阿片類藥物(Opioids)主要被用于臨床麻醉、急慢性痛和癌性痛的治療。其引發(fā)的痛敏效應(yīng)因與其鎮(zhèn)痛初衷相悖,很大程度上制約了Opioids的臨床使用。瑞芬太尼(Remifentanil)常用于臨床復(fù)合麻醉,但多篇文獻報道其鎮(zhèn)痛作用消除快使瑞芬太尼誘發(fā)痛覺過敏(RIH)的發(fā)生率顯著高于其他Opioids。因此明確RIH發(fā)生的關(guān)鍵性分子機理并尋找確切的治療靶點具有重要意義。蛋白激酶Mζ(PKMζ)是非典型PKC家族成員,具有固有活性,其處于持續(xù)活化狀態(tài)是保持突觸效能的重要機制。有研究證實,PKMζ調(diào)節(jié)突觸結(jié)構(gòu)重塑和AMPA受體功能誘導(dǎo)并維持突觸功能重塑是神經(jīng)病理性痛和炎性痛中樞敏化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。Kalirin是一類興奮性突觸神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)的蛋白分子,在協(xié)調(diào)樹突棘數(shù)量、突觸發(fā)育、學(xué)習(xí)記憶等過程中發(fā)揮重要作用。其中,Kalirin-7與AMPA受體信號傳導(dǎo)系統(tǒng)關(guān)系最為密切。最新研究發(fā)現(xiàn),Kalirin-7也參與了疼痛相關(guān)的興奮性神經(jīng)突觸重塑,介導(dǎo)痛覺信息的儲存,形成并鞏固痛覺敏化。故我們推測PKMζ通過Kalirin-7介導(dǎo)樹突棘結(jié)構(gòu)重塑和AMPA受體功能可能是RIH的發(fā)生機制。本研究擬建立大鼠在體切口痛—RIH模型和體外孵育瑞芬太尼模型,探討PKMζ和Kalirin-7對RIH大鼠脊髓背角興奮性神經(jīng)突觸結(jié)構(gòu)和功能重塑的分子機理,從而為臨床合理有效地防治瑞芬太尼引發(fā)痛覺過敏提供新的靶點。目的通過評價切口痛-瑞芬太尼痛覺過敏大鼠脊髓背角PKMζ活性、Kalirin-7表達(dá)和AMPA受體轉(zhuǎn)運水平的變化,探討其在瑞芬太尼引發(fā)痛覺過敏中的可能機制;通過鞘內(nèi)注射PKMζ選擇性抑制劑ZIP,探討其對瑞芬太尼痛覺過敏大鼠脊髓背角Kalirin-7表達(dá)和AMPA受體轉(zhuǎn)運的影響;通過鞘內(nèi)注射kalirin-7-shRNA基因沉默kalirin-7,探討其對瑞芬太尼痛覺過敏大鼠痛閾和AMPA受體轉(zhuǎn)運的影響;通過鞘內(nèi)注射GluA1選擇性拮抗劑NASPM,探討其對瑞芬太尼痛覺過敏大鼠痛閾的影響;通過鞘內(nèi)注射ZIP和kalirin-7-shRNA抑制PKMζ和Kalirin-7,探討其對瑞芬太尼痛覺過敏大鼠脊髓背角樹突棘形態(tài)學(xué)的影響;探討PKMζ和Kalirin-7在瑞芬太尼誘發(fā)大鼠脊髓背角神經(jīng)元AMPA受體微小興奮性突觸后膜電流(mEPSCs)中的作用。方法一雄性SD大鼠44只(240~260g),隨機分為4組(n=11):C組(假手術(shù)+生理鹽水組):假手術(shù),生理鹽水0.1 ml·kg~(-1)·min~(-1),1h,尾靜脈輸注;I組(切口痛組):建立Brennan切口痛模型;R組(Remifentanil組):瑞芬太尼1.0μg·kg~(-1)·min~(-1),1h,尾靜脈輸注;IR組(Remifentanil+切口痛組):建立Brennan切口痛模型,瑞芬太尼1.0μg·kg~(-1)·min~(-1),1h,尾靜脈輸注。于輸注前1 d、輸注后2 h、6 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d,每組取7只大鼠分別測定熱刺激縮足潛伏期(PWL)和機械刺激縮足閾值(PWT);于輸注后2 d,每組取4只大鼠處死并取脊髓背角L_(4-6)節(jié)段,采用免疫組化和Western Blot法測定PKMζ活性、Kalirin-7表達(dá)和AMPA受體轉(zhuǎn)運水平。二雄性SD大鼠66只(240~260g),隨機分為6組(n=11):C組:假手術(shù),生理鹽水0.1 ml·kg~(-1)·min~(-1),1h,尾靜脈輸注;IR組:瑞芬太尼1.0μg·kg~(-1)·min~(-1),1h,尾靜脈輸注,建立Brennan切口痛模型;C+Z_3組:鞘內(nèi)注射ZIP 100nmol后即刻開始靜脈輸注生理鹽水;Z_1,Z_2,Z_3組:分別鞘內(nèi)注射ZIP 1nmol,10nmol,100nmol后即刻開始輸注瑞芬太尼。于輸注前1 d、輸注后2 h、6 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d,每組取7只大鼠分別測定PWL和PWT;于輸注后2 d,每組取4只大鼠處死并取脊髓背角L_(4-6)節(jié)段,采用Western Blot法測定Kalirin-7表達(dá)和AMPA受體轉(zhuǎn)運水平。三雄性SD大鼠44只(240~260g),隨機分為4組(n=11):C組:假手術(shù),生理鹽水0.1 ml·kg~(-1)·min~(-1),1h,尾靜脈輸注;IR組:瑞芬太尼1.0μg·kg~(-1)·min~(-1),1h,尾靜脈輸注,建立Brennan切口痛模型;C+kalirin-7-shRNA組:鞘內(nèi)注射kalirin-7-shRNA(10μL;3×10~8 transducing units[TU]/mL),2周后待轉(zhuǎn)染成功,生理鹽水0.1 ml·kg~(-1)·min~(-1),1h,尾靜脈輸注;IR+kalirin-7-shRNA組:鞘內(nèi)注射kalirin-7-shRNA(10μL;3×10~8 transducing units[TU]/mL),2周后待轉(zhuǎn)染成功,瑞芬太尼1.0μg·kg~(-1)·min~(-1),1h,尾靜脈輸注,建立Brennan切口痛模型。于輸注前1 d、輸注后2 h、6 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d,每組取7只大鼠分別測定PWL和PWT;于輸注后2 d,每組取4只大鼠處死并取脊髓背角L_(4-6)節(jié)段,采用Western Blot法測定PKMζ活性和AMPA受體轉(zhuǎn)運水平。四雄性SD大鼠66只(240~260g),隨機分為6組(n=11):C組:假手術(shù),生理鹽水0.1 ml·kg~(-1)·min~(-1),1h,尾靜脈輸注;IR組:瑞芬太尼1.0μg·kg~(-1)·min~(-1),1h,尾靜脈輸注,建立Brennan切口痛模型;C+N_3組:鞘內(nèi)注射NASPM 100μg后即刻開始靜脈輸注生理鹽水;N_1,N_2,N_3組:分別鞘內(nèi)注射NASPM 1μg,10μg,100μg后即刻開始輸注瑞芬太尼。于輸注前1 d、輸注后2 h、6 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d,每組取7只大鼠分別測定PWL和PWT;于輸注后2 d,每組取4只大鼠處死并取脊髓背角L_(4-6)節(jié)段,采用Western Blot法測定AMPA受體轉(zhuǎn)運水平。五雄性SD大鼠16只(240~260g),隨機分為4組(n=4):C組:假手術(shù),生理鹽水0.1 ml·kg~(-1)·min~(-1),1h,尾靜脈輸注;IR組:瑞芬太尼1.0μg·kg~(-1)·min~(-1),1h,尾靜脈輸注,建立Brennan切口痛模型;IR+ZIP組:瑞芬太尼輸注前鞘內(nèi)注射ZIP 100nmol;IR+kalirin-7-shRNA組:鞘內(nèi)注射kalirin-7-shRNA(10μL;3×10~8transducing units[TU]/mL),2周后待轉(zhuǎn)染成功,建立Brennan切口痛模型并輸注瑞芬太尼。于輸注后2 d,處死全部大鼠并取脊髓背角L_(4-6)節(jié)段,采用高爾基染色法測定樹突棘的長度和數(shù)量。六取出生5-7周的SD大鼠16只,隨機分為4組(n=4):C組:取脊髓(L_(4-5)),制備脊髓片,人工腦脊液孵育1h;R組:使用含有瑞芬太尼(4 nM)的人工腦脊液中孵育脊髓片1h;ZIP組:制備脊髓切片,置入含瑞芬太尼(4 nM)和ZIP(5μM)的人工腦脊液中孵育1h;kalirin-7-shRNA組:鞘內(nèi)注射kalirin-7-shRNA(10μL;3×10~8 transducing units[TU]/mL),2周后待轉(zhuǎn)染成功,制備脊髓切片,置入含瑞芬太尼(4 nM)的人工腦脊液中孵育1h。全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)評價大鼠脊髓背角神經(jīng)元AMPA受體的電生理功能。結(jié)果一與C組相比,I、R和IR組的PWT和PWL降低;PKMζ磷酸化水平升高;Kalirin-7表達(dá)增多;膜/總蛋白中GluA1的表達(dá)和轉(zhuǎn)運增加(P0.05)。與I組相比,IR組的PWT和PWL顯著降低;PKMζ磷酸化水平升高;Kalirin-7表達(dá)增多;膜/總蛋白中GluA1的表達(dá)和轉(zhuǎn)運增加(P0.05)。各組GluA2表達(dá)和轉(zhuǎn)運水平均無顯著差異(P0.05)。二與C組比較,IR、Z_1、Z_2、Z_3組的PWT和PWL明顯降低;PKMζ磷酸化水平升高;Kalirin-7表達(dá)增多;膜/總蛋白中GluA1的表達(dá)和轉(zhuǎn)運增加(P0.05)。與IR組相比,Z_2和Z_3組的PWT和PWL明顯升高,PKMζ磷酸化水平降低;Kalirin-7表達(dá)下調(diào);膜/總蛋白中GluA1的表達(dá)和轉(zhuǎn)運減少,且存在劑量依賴(P0.05)。三與C組比較,IR和IR+kalirin-7-shRNA組的PWT和PWL明顯降低;PKMζ磷酸化水平升高;膜/總蛋白中GluA1的表達(dá)和轉(zhuǎn)運增加(P0.05)。與IR組相比,IR+kalirin-7-shRNA組的PWT和PWL明顯升高;膜/總蛋白中GluA1的表達(dá)減少(P0.05);但PKMζ磷酸化水平未見顯著性改變(P0.05)。四與C組比較,IR、N_1、N_2、N_3組的PWT和PWL明顯降低;膜/總蛋白中GluA1的表達(dá)和轉(zhuǎn)運增加(P0.05)。與IR組相比,N_2和N_3組的PWT和PWL明顯升高,膜蛋白中GluA1的表達(dá)減少,且存在劑量依賴(P0.05)。五與C組比較,IR、IR+ZIP和IR+kalirin-7-shRNA組的樹突棘的數(shù)量和長度均顯著增加(P0.05)。與IR組相比,IR+ZIP和IR+kalirin-7-shRNA組的樹突棘數(shù)量和長度明顯減少(P0.05)。六與C組比較,R、ZIP和kalirin-7-shRNA組AMPA-mEPSCs的振幅和頻率升高(P0.05)。與R組比較,ZIP和kalirin-7-shRNA組振幅和頻率降低(P0.05)。結(jié)論瑞芬太尼麻醉可加重切口痛導(dǎo)致的術(shù)后痛覺過敏現(xiàn)象;切口痛-瑞芬太尼痛覺過敏大鼠脊髓背角PKMζ活性升高、Kalirin-7合成增多及GluA1靶向突觸后膜轉(zhuǎn)運增加;抑制脊髓水平PKMζ對大鼠瑞芬太尼機械痛敏和熱痛敏具有預(yù)防作用,其機制可能是下調(diào)脊髓背角Kalirin-7表達(dá)和AMPA受體轉(zhuǎn)運;抑制脊髓水平kalirin-7對大鼠瑞芬太尼機械痛敏和熱痛敏具有預(yù)防作用,其機制可能是下調(diào)脊髓背角AMPA受體靶向突觸后膜轉(zhuǎn)運;抑制脊髓水平GluA1靶向突觸后膜轉(zhuǎn)運對大鼠瑞芬太尼機械痛敏和熱痛敏具有預(yù)防作用;瑞芬太尼麻醉后可引起脊髓背角PKMζ和Kalirin-7活化,從而調(diào)控樹突棘結(jié)構(gòu)重塑,可能是RIH發(fā)生的關(guān)鍵;瑞芬太尼孵育后可上調(diào)PKMζ和Kalirin-7活性,進而介導(dǎo)興奮性谷氨酸能神經(jīng)突觸功能重塑,這可能是瑞芬太尼痛覺過敏的核心機制。
【圖文】：

增強對外周傳入沖動的突觸反應(yīng)進而“學(xué)習(xí)”新的信息，形成記憶并儲存這信息在中樞突觸。蛋白激酶 Mζ (protein kinase Mζ, PKMζ) 是非典型蛋白 (protein kinase C, PKC) 家族成員。蛋白激酶 Mζ 只有獨立催化域，缺乏，無自身抑制功能，故具固有活性，，是突觸重塑誘導(dǎo)和維持的靶控蛋白習(xí)記憶過程中具有關(guān)鍵作用[36-39]。有研究證實，NMDA 受體活化引起鈣細(xì)胞內(nèi)大量的涌入，激活鈣調(diào)蛋白激酶 (Calmodulin-dependent protein kinaMKⅡ) 等下游靶點蛋白從而使蛋白激酶 Mζ 的翻譯阻滯被有效快速解磷酸肌醇依賴性蛋白激酶 1（Phosphoinostide-dependent kinase1, PDK1）蛋白激酶 Mζ，使其改變構(gòu)象，從而使蛋白激酶 Mζ 從剛合成的低活性狀為高活性狀態(tài)，進而高效參與下游靶點分子的激活，最終調(diào)節(jié) AMPA 受改變和功能活化誘導(dǎo)和維持突觸可塑性改變（圖 1）[40]。新近研究報道，酶 Mζ 也參與了疼痛相關(guān)中樞興奮性神經(jīng)突觸重塑，介導(dǎo)痛覺信息的儲并鞏固“痛覺記憶”，是調(diào)控神經(jīng)病理性痛和炎性痛中樞敏化的重要機制]。但 PKMζ-AMPA 受體膜上位（membrane insertion）是否誘發(fā)并介導(dǎo)瑞痛敏記憶形成，有待研究。

PKMζ 的神經(jīng)元成熟樹突棘（蘑菇狀）數(shù)量增多，有利于形成功能性突觸，促進 AMPA 受體在突觸后膜定位，增強 mEPSCs，維持突觸功能可塑性及突觸間信息傳遞。Kalirin 是一類興奮性神經(jīng)突觸胞質(zhì)內(nèi)的蛋白分子，生物功能主要有激發(fā)神經(jīng)元突起生長、增加樹突棘數(shù)量，在協(xié)調(diào)突觸發(fā)育和學(xué)習(xí)記憶中扮演重要角色[51, 52]。其中，Kalirin-7 與興奮性谷氨酸受體系統(tǒng)關(guān)系最為密切，多篇文獻證實 Kalirin-7 可直接介導(dǎo) AMPA 受體膜上位參與突觸可塑性和記憶形成[53-55]。Xie 等[56]報道 NMDA 受體活化后，可以促進 CaMKⅡ依賴的 Kalirin-7表達(dá)和磷酸化，Kalirin-7 活化后可直接調(diào)控 GluA1 亞基膜轉(zhuǎn)位，增強 AMPA 受體介導(dǎo)的 mEPSCs，促進樹突棘增大，增加成熟樹突棘數(shù)量，形成功能性突觸，維持突觸重塑。而激活 CaMKⅡ也可促進 PKMζ 表達(dá)和活化，調(diào)控相關(guān)靶蛋白磷酸化，介導(dǎo)下游 AMPA 受體膜上位，維持突觸效能[57]。故我們推測 PKMζ—Kalirin-7 介導(dǎo)突觸重塑可能參與 RIH 發(fā)生（圖 2）。因此，本研究擬通過建立切口痛-瑞芬太尼痛敏大鼠模型，探討興奮性突觸結(jié)構(gòu)和功能可塑性改變在 RIH中的分子機理，為其臨床防治提供新的靶點。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R614

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 馬劍鋒;黃志蓮;李軍;胡社軍;連慶泉;;瑞芬太尼致術(shù)后患者痛覺過敏的隊列研究[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2011年14期

本文編號：2652202