本文關(guān)鍵詞：miRNA-126與大鼠DVT血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的相關(guān)性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：[目的]深靜脈血栓(DVT)是骨科手術(shù)常見并發(fā)癥,常導(dǎo)致嚴(yán)重后果,其機制復(fù)雜,需繼續(xù)深入探索。近年來研究發(fā)現(xiàn),血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)凋亡在DVT的發(fā)病機制中起著重要作用,而這一過程可能與microRNAs相關(guān)。研究表明microRNAs廣泛參與調(diào)控細(xì)胞分化、增殖、凋亡等生理及病理生理過程,且miR-126是與VEC及血管功能密切相關(guān)的microRNA,提示miR-126可能參與了VEC凋亡的調(diào)控。此外,研究還顯示,Bcl-2, Bad表達(dá)在不同組織及細(xì)胞凋亡的過程中存在差異性表達(dá)。因此,本實驗在構(gòu)建miR-126基因沉默/高表達(dá)的大鼠DVT模型后,采用HE染色、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試驗來觀察miR-126表達(dá)變化對DVT形成及內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。并通過Western bolt分析Bcl-2, Bad表達(dá)在不同組中的表達(dá)變化,探尋miR-126與DVT靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及Bcl-2, Bad的相關(guān)性,為DVT防治新方法提供理論依據(jù)和新靶點。[材料和方法]1.分組及造模：將72只SD大鼠(250±20g),雌雄各半、年齡不限,隨機分為4組。A、正常對照組(12只)：給予腹腔注射20ml生理鹽水,不進行其他處理。B、DVT模型組(20只)：給予腹腔注射20ml生理鹽水,四天后腹腔麻醉,腹正中線逐層開腹,分離暴露下腔靜脈,5-0愛惜康縫合線沿下腔靜脈平行、緊貼放置,再用4-0愛惜康縫合線結(jié)扎此處下腔靜脈,再抽去并排的5-0愛惜康縫合線,關(guān)腹,正常飼養(yǎng)；C、miRNA-126沉默組(20只)：給予腹腔注射含400pmol antagomir的轉(zhuǎn)染化合物20ml,構(gòu)建miR-126基因沉默的大鼠模型,四天后處理同DVT模型組；D、miRNA-126高表達(dá)組(20只)：給予腹腔注射含400pmol agomir的轉(zhuǎn)染化合物20ml,構(gòu)建miR-126基因高表達(dá)的大鼠模型,四天后處理同DVT模型組；2、靜脈壁采集及病理檢查根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果,分別于造模后2h、24h隨機抽取正常組、DVT模型組、miRNA-126沉默組、miRNA-126高表達(dá)組大鼠各半數(shù),經(jīng)麻醉消毒后開腹切取結(jié)扎線至髂總靜脈分叉處之間2cm長的下腔靜脈及其內(nèi)容物,肉眼下觀察是否有血栓形成,并將部分新鮮組織以4%多聚甲醛固定后送石蠟切片觀察血栓形成狀態(tài),其余部分經(jīng)生理鹽水沖洗,去掉管內(nèi)外血栓后迅速放人凍存管,置入液氨罐保存。3、采用TUNEL染色觀察靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況從液氨罐中取出不同時間點位各組分組織快速作石蠟切片,并按照TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(上海翊圣)說明書操作檢測靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡發(fā)生情況,經(jīng)DAPI復(fù)染后在熒光顯微鏡下觀察及拍攝。4、Western bolt檢測SD大鼠DVT靜脈壁組織中Bcl-2, Bad的蛋白表達(dá)變化A、使用組織裂解液對不同時間位點保存于液氮中的各組靜脈壁材料進行總蛋白的提取并用BCA法測定總蛋白濃度。B、制備SDS-PAGE電泳后進行轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育等操作；以ChemiScop Series3600化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)拍照顯示結(jié)果,并用Chemi Analysis分析計算灰度值。C、選用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)處理,各組數(shù)值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA);各組結(jié)果以P0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。[結(jié)果]1、肉眼觀察血栓形成情況2h位點,大鼠DVT組、沉默組及高表達(dá)組肉眼觀可見有靜脈管壁水腫,顏色加深,未見明顯血栓形成；在24h位點,除正常組外,其余三組靜脈管壁明顯水腫,下腔靜脈明顯腫脹及青紫,內(nèi)有大量血栓形成,并以DVT模型組及miRNA-126沉默組最明顯。2、HE染色觀察血栓形成情況2h位點,各組大鼠HE染色無明顯血栓形成,但DVT模型組及miRNA-126沉默可見多量紅細(xì)胞集聚,在24h時可見DVT組及miRNA-126沉默組完全血栓形成,miRNA-126高表達(dá)組不完全性血栓形成。3、Tunel凋亡實驗在不同時間位點,通過觀察熒光密度(即細(xì)胞凋亡程度)判斷細(xì)胞凋亡情況；在2h時,miR-126沉默組內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞凋亡情況較DVT模型組重,而正常組及miR-126高表達(dá)組未看到明顯細(xì)胞凋亡；至24h,除正常組外均可見內(nèi)皮細(xì)胞凋亡發(fā)生。與DVT模型組相比,miR-126沉默組凋亡程度重,miR-126過表達(dá)組,細(xì)胞凋亡程度較輕。4、Western bolt檢測Bcl-2, Bad蛋白與正常組相比,各組Bel-2、Bad表達(dá)水平在不同時間位點發(fā)生了改變。結(jié)合統(tǒng)計學(xué)分析,在2h,Bcl-2表達(dá)組內(nèi)不全相等(F=2982.881,p0.001),有統(tǒng)計學(xué)差異,在24h位點,Bcl-2組內(nèi)不全相等(F=352.747,p0.001),有統(tǒng)計學(xué)意義,在2h、24h位點,DVT組與miRNA高表達(dá)組、miRNA沉默組與miRNA高表達(dá)組差異明顯(P0.001)；在2h位點,Bad表達(dá)組內(nèi)不全相等(F=571.01,p0.001)有統(tǒng)計學(xué)差異,在24h位點,Bad組內(nèi)不全相等(F=393.684,p0.001),有統(tǒng)計學(xué)意義,在2h、24h位點,DVT組與miRNA高表達(dá)組、miRNA沉默組與miRNA高表達(dá)組Bad表達(dá)差異明顯(P0.001)。[結(jié)論]l、miR-126與DVT形成及靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡呈負(fù)相關(guān)2、miR-126與Bcl-2表達(dá)水平呈正相關(guān),與Bad表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)
【關(guān)鍵詞】：深靜脈血栓 內(nèi)皮細(xì)胞凋亡 miR-126 Bcl-2 Bad
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R619
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-12
• 中英文縮略詞表12-14
• 前言14-18
• 材料和方法18-33
• 結(jié)果33-42
• 討論42-51
• 結(jié)論51-52
• 參考文獻(xiàn)52-57
• 綜述57-63
• 參考文獻(xiàn)61-63
• 作者讀書期間基本情況63-64
• 致謝64

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本文編號：264113