【摘要】：布比卡因是臨床常用的局部麻醉藥(local anesthetic,簡稱局麻藥),也常用于治療急性及慢性疼痛,布比卡因的毒性強(qiáng)于其他局麻藥。機(jī)體過量的布比卡因暴露可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性和心血管系統(tǒng)毒性;但是與誘發(fā)心血管毒性相比,布比卡因誘發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性的血藥濃度更低。至今布比卡因等局麻藥引起神經(jīng)毒性的機(jī)制仍未闡明。以大鼠海馬切片為標(biāo)本的研究結(jié)果顯示,局麻藥可以抑制海馬的長時(shí)程增強(qiáng)現(xiàn)象。據(jù)報(bào)道,海馬對局麻藥誘發(fā)的驚厥高度敏感。但是關(guān)于局麻藥對原代培養(yǎng)海馬細(xì)胞的作用卻鮮有報(bào)道。谷氨酸是參與人腦高級功能的重要神經(jīng)遞質(zhì),因此我們采用原代培養(yǎng)的胎鼠海馬神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞,利用免疫熒光技術(shù)、鈣成像技術(shù)和雙光子顯微鏡技術(shù),觀察了布比卡因?qū)劝彼峤閷?dǎo)大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)游離鈣(intracellular free Ca~(2+)concentration,[Ca~(2+)]_i)升高的影響,布比卡因?qū)Υ笫蠛ｑR星形膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元線粒體膜電位及活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成的影響,以及布比卡因?qū)Υ笫蠛ｑR星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)功能的影響。第一部分布比卡因?qū)劝彼嵴T導(dǎo)大鼠海馬細(xì)胞內(nèi)鈣升高的影響目的:探究布比卡因?qū)劝彼峤閷?dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞鈣信號的影響。方法:原代培養(yǎng)大鼠胎鼠海馬神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞,應(yīng)用免疫熒光技術(shù)鑒定單獨(dú)培養(yǎng)的神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞純度。利用鈣成像技術(shù)記錄谷氨酸對兩類神經(jīng)細(xì)胞[Ca~(2+)]_i的作用及布比卡因?qū)劝彼嵴T導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞[Ca~(2+)]_i變化的影響。結(jié)果:1.谷氨酸對單獨(dú)或混合培養(yǎng)海馬細(xì)胞[Ca~(2+)]_i升高的比較星形膠質(zhì)細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)時(shí),首次給予1 mM谷氨酸(10 s)誘發(fā)細(xì)胞[Ca~(2+)]_i上升的峰值為239±40%,與混合培養(yǎng)條件下星形膠質(zhì)細(xì)胞首次暴露于1 mM谷氨酸時(shí)細(xì)胞[Ca~(2+)]_i峰值(233±42%)相比,無顯著性差異(P0.05)。然而,海馬神經(jīng)元單獨(dú)培養(yǎng)時(shí),首次給予1 mM谷氨酸(10s)誘發(fā)細(xì)胞[Ca~(2+)]_i上升的峰值為240±81%,該峰值顯著高于混合培養(yǎng)條件下,首次給予1 mM谷氨酸誘發(fā)海馬神經(jīng)元[Ca~(2+)]_i上升的峰值(169±20%,P0.01)。2.布比卡因?qū)劝彼嵴T發(fā)海馬細(xì)胞[Ca~(2+)]_i升高的影響在混合培養(yǎng)狀態(tài)下,300μM布比卡因(孵育5 min)使星形膠質(zhì)細(xì)胞對1 mM谷氨酸的反應(yīng)顯著減弱(P0.01)。相反,當(dāng)混合培養(yǎng)狀態(tài)下的神經(jīng)元與300μM布比卡因孵育5 min后,神經(jīng)元[Ca~(2+)]_i對谷氨酸的反應(yīng)顯著增強(qiáng)(P0.01)。單獨(dú)培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞與300μM布比卡因孵育5 min后,其對第二次谷氨酸刺激的反應(yīng)顯著下降(P0.01),峰值、曲線下面積和Tau值的變化程度與混合培養(yǎng)時(shí)相似。單獨(dú)培養(yǎng)的神經(jīng)元與同濃度布比卡因孵育5 min后,第二次給予谷氨酸所誘發(fā)神經(jīng)元[Ca~(2+)]_i上升的峰值,與布比卡因預(yù)處理前谷氨酸引起的神經(jīng)元[Ca~(2+)]_i變化相比,未見顯著差異(P0.05)。3.布比卡因及羅哌卡因?qū)劝彼嵴T發(fā)海馬細(xì)胞[Ca~(2+)]_i升高的量效關(guān)系研究在混合培養(yǎng)狀態(tài)下,兩類細(xì)胞對布比卡因及羅哌卡因的反應(yīng)均呈濃度依賴性。布比卡因?qū)深惣?xì)胞的作用,自0.3μM開始起效,于300μM達(dá)峰值;布比卡因?qū)π切文z質(zhì)細(xì)胞作用的EC_(50)為1.64μM,對神經(jīng)元作用的EC_(50)為1.76μM。羅哌卡因?qū)深惣?xì)胞的起效濃度為3μM,峰值濃度為3000μM;EC_(50)分別為15.51μM(星形膠質(zhì)細(xì)胞)和16.18μM(神經(jīng)元)。小結(jié):酰胺類局麻藥顯著抑制谷氨酸誘發(fā)的大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞[Ca~(2+)]_i升高卻增強(qiáng)谷氨酸誘發(fā)的混合培養(yǎng)的神經(jīng)元[Ca~(2+)]_i升高。布比卡因?qū)Υ笫蠛ｑR神經(jīng)元的毒性作用(增強(qiáng)谷氨酸誘發(fā)的神經(jīng)元[Ca~(2+)]_i升高)可能源于其對星形膠質(zhì)細(xì)胞的直接抑制作用。第二部分布比卡因?qū)Υ笫蠛ｑR細(xì)胞線粒體膜電位及ROS生成的影響目的:探究布比卡因?qū)ｑR細(xì)胞線粒體膜電位及ROS生成的影響。方法:培養(yǎng)原代大鼠胎鼠海馬細(xì)胞,利用JC-1染料在雙光子顯微鏡下觀察布比卡因?qū)?xì)胞線粒體膜電位的影響,使用DCFH-DA染料及細(xì)胞內(nèi)ROS熒光試劑盒并利用離子成像技術(shù)記錄布比卡因影響兩類細(xì)胞ROS的變化。結(jié)果:1.布比卡因?qū)旌吓囵B(yǎng)的海馬細(xì)胞線粒體膜電位的影響對混合培養(yǎng)的海馬細(xì)胞,給予300μM布比卡因處理后,神經(jīng)元的線粒體膜電位未見明顯改變;另一方面,給予300μM布比卡因后,星形膠質(zhì)細(xì)胞的線粒體膜電位降低幅度達(dá)60%。2.布比卡因?qū)为?dú)培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體膜電位的影響及環(huán)孢菌素A的逆轉(zhuǎn)作用在單獨(dú)培養(yǎng)狀態(tài)下,神經(jīng)元的線粒體膜電位依然不受300μM布比卡因的影響。與混合培養(yǎng)時(shí)相同,給予300μM布比卡因后,單獨(dú)培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的線粒體膜電位出現(xiàn)顯著降低。對單獨(dú)培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞給予1μM環(huán)孢菌素A(cyclosporin A,CsA)預(yù)處理后,0.3-300μM布比卡因降低線粒體膜電位的作用受到顯著抑制。3.布比卡因?qū)为?dú)培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞ROS生成的誘導(dǎo)作用及CsA的逆轉(zhuǎn)作用對單獨(dú)培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元使用DCFH-DA染色后,給予300μM布比卡因不影響神經(jīng)元內(nèi)ROS的生成,但可顯著增加星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ROS的生成,增加幅度可達(dá)130%。若使用1μM CsA預(yù)處理5 min,可顯著抑制300μM布比卡因誘發(fā)的ROS生成,抑制率達(dá)81%。小結(jié):布比卡因可顯著降低星形膠質(zhì)細(xì)胞的線粒體膜電位,并顯著增加ROS生成。但布比卡因無法對神經(jīng)元的線粒體膜電位或ROS生成產(chǎn)生相似影響。Cs A可逆轉(zhuǎn)布比卡因?qū)π切文z質(zhì)細(xì)胞線粒體膜電位的降低作用及ROS生成的增加作用。布比卡因很可能是通過損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞的線粒體功能,進(jìn)而間接對神經(jīng)元產(chǎn)生影響。第三部分布比卡因調(diào)節(jié)谷氨酸升高大鼠海馬細(xì)胞內(nèi)鈣的相關(guān)機(jī)制研究目的:探究布比卡因?qū)劝彼嵘叽笫蠛ｑR細(xì)胞[Ca~(2+)]_i的作用機(jī)制。方法:培養(yǎng)原代大鼠胎鼠海馬細(xì)胞,應(yīng)用鈣成像技術(shù)記錄布比卡因?qū)?xì)胞[Ca~(2+)]_i的影響。結(jié)果:1.無鈣外液及丹曲林對谷氨酸誘發(fā)的單獨(dú)培養(yǎng)神經(jīng)元[Ca~(2+)]_i升高的影響將鈣成像實(shí)驗(yàn)中的含鈣外液替換為含有5 mM EGTA的無鈣外液后,再次對單獨(dú)培養(yǎng)的神經(jīng)元給予1 mM谷氨酸,此時(shí)谷氨酸無法產(chǎn)生誘發(fā)[Ca~(2+)]_i升高的現(xiàn)象,聯(lián)合使用300μM的布比卡因亦不能改變這一現(xiàn)象。對單獨(dú)培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞使用10μM丹曲林預(yù)處理后,其對谷氨酸產(chǎn)生的[Ca~(2+)]_i升高反應(yīng)無顯著改變(P0.05);300μM布比卡因聯(lián)合10μM丹曲林預(yù)處理,亦對單獨(dú)培養(yǎng)的神經(jīng)元[Ca~(2+)]_i升高現(xiàn)象無顯著作用(P0.05)。2.CsA抑制布比卡因?qū)劝彼嵴T發(fā)海馬細(xì)胞[Ca~(2+)]_i升高的作用在混合培養(yǎng)狀態(tài)下,使用300μM布比卡因聯(lián)合1μM CsA孵育5 min后,布比卡因抑制谷氨酸誘發(fā)星形膠質(zhì)細(xì)胞[Ca~(2+)]_i升高的作用幾乎消失;同樣,布比卡因增強(qiáng)谷氨酸誘發(fā)海馬神經(jīng)元[Ca~(2+)]_i升高的作用也幾乎消失。3.谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑對布比卡因作用的影響對混合培養(yǎng)的兩類海馬細(xì)胞,使用谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體特異性抑制劑二氫乙酸500μM預(yù)處理后,第一次給予1 mM谷氨酸所誘發(fā)星形膠質(zhì)細(xì)胞[Ca~(2+)]_i上升的峰值為284±53%,神經(jīng)元[Ca~(2+)]_i上升的峰值為237±156%。在二氫乙酸的存在下,300μM布比卡因仍可顯著抑制第二次給予1 mM谷氨酸所誘發(fā)的星形膠質(zhì)細(xì)胞[Ca~(2+)]_i升高的作用(P0.01),但300μM布比卡因增強(qiáng)1 mM谷氨酸誘發(fā)神經(jīng)元[Ca~(2+)]_i上升的作用消失(P0.05)。小結(jié):谷氨酸主要通過外鈣內(nèi)流引起神經(jīng)元內(nèi)鈣升高。CsA可逆轉(zhuǎn)布比卡因?qū)深惣?xì)胞內(nèi)鈣升高的影響。臨床常用濃度的局麻藥布比卡因直接作用于海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞,損傷混合培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體,進(jìn)而抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取谷氨酸的功能,導(dǎo)致培養(yǎng)體系中神經(jīng)元周圍的谷氨酸濃度升高,間接增強(qiáng)谷氨酸誘發(fā)的神經(jīng)元[Ca~(2+)]_i升高。結(jié)論:酰胺類局麻藥顯著抑制谷氨酸誘發(fā)的大鼠胎鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞[Ca~(2+)]_i升高卻增強(qiáng)谷氨酸誘發(fā)的混合培養(yǎng)神經(jīng)元[Ca~(2+)]_i升高,其作用機(jī)制與局麻藥選擇性阻滯鈉離子通道的作用無關(guān)。臨床常用濃度的局麻藥布比卡因直接作用于海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞,損傷混合培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體,進(jìn)而抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取谷氨酸的功能,導(dǎo)致培養(yǎng)體系中神經(jīng)元周圍的谷氨酸濃度升高,間接增強(qiáng)谷氨酸誘發(fā)的神經(jīng)元[Ca~(2+)]_i升高。
【圖文】：

圖 1-6 谷氨酸引起海馬神經(jīng)細(xì)胞[Ca2+]i升高受不同培養(yǎng)體系的影響Fig.1-6 Effects of the different culture system on glutamate-induced [Ca2+]iincreases. The increase in [Ca2+]iinduced by 1 mM glutamate did not changesignificantly in pure culture of astrocytes or astrocytes co-cultured withneurons (A, typical traces; B, changes in peak values, n = 14 and 13 forco-cultured and pure astrocytes, respectively). The increase in [Ca2+]iinducedby 1 mM glutamate was enhanced in pure culture of neurons than in neuronsco-cultured with astrocytes (C, typical traces; D, changes in peak values, n =14 and 18 for co-cultured and pure neurons, respectively). Cells were exposedto 1 mM glutamate for 10 s, and the data are expressed as the means ±SD.**P < 0.01 compared with the first glutamate-induced responses in purecultures of neurons using an unpaired t-test.

圖 1-8 布比卡因?qū)劝彼嵴T發(fā)的單獨(dú)培養(yǎng)神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞[Ca2+]i升高的影響Fig.1-8 Effects of bupivacaine on the glutamate-induced [Ca2+]iincrease inpure cultured neurons and astrocytes. Effects of a 5 min incubation with 300μM bupivacaine on the glutamate-induced increases in [Ca2+]iin pure culturesof astrocytes (A, a typical trace; B, changes in peak, AUC and Tau values, n =13) and pure cultures of neurons (C, a typical trace; D, changes in peak, AUCand Tau values, n = 18) were investigated. Cells were exposed to 1 mMglutamate for 10 s, and the data are expressed as the means ±SD. **P < 0.01compared with the glutamate-induced responses before the bupivacainetreatment using a paired t-test.
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R614

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7 華福洲;IL-17A介導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化及調(diào)控Act1/IRF-1信號通路在POCD形成的機(jī)制研究[D];南昌大學(xué);2016年

8 柳秀平;蛋白磷酸酯酶-2A對星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移的促進(jìn)作用及其機(jī)制研究[D];華中科技大學(xué);2012年

9 高蓓;視上核星形膠質(zhì)細(xì)胞對急性腹腔高滲刺激引起的神經(jīng)元反應(yīng)的調(diào)節(jié)及其機(jī)制[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2008年

10 李燕華;AQP4在星形膠質(zhì)細(xì)胞水的轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2004年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 劉國偉;葉酸在星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用及其機(jī)制研究[D];山東大學(xué);2018年

2 王勝紅;內(nèi)源性大麻素2-AG參與抑制脂多糖誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)機(jī)制研究[D];蘭州大學(xué);2018年

3 黃燕;慢性腦低灌注致大鼠海馬神經(jīng)血管單元相關(guān)的星形膠質(zhì)細(xì)胞足突改變的研究[D];西南醫(yī)科大學(xué);2018年

4 王欣宇;脂氧素A_4對星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)中AQP4的影響及機(jī)制研究[D];鄭州大學(xué);2018年

5 李慧;壓力介導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化對其分泌睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的影響[D];中國醫(yī)科大學(xué);2018年

6 黃國興;六價(jià)鉻對大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞及學(xué)習(xí)記憶的影響[D];錦州醫(yī)科大學(xué);2018年

7 張繼林;白細(xì)胞介素-11調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化促進(jìn)腦出血損傷修復(fù)的研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2018年

8 陳筱詩;右美托咪定預(yù)處理對星形膠質(zhì)細(xì)胞HMGB1表達(dá)的影響[D];湖北醫(yī)藥學(xué)院;2018年

9 李娜;淫羊藿苷抗原代星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究[D];青島大學(xué);2018年

10 戶雪雪;脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞的Cav3.2在神經(jīng)病理性痛中的作用研究[D];南昌大學(xué);2018年

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