本文關(guān)鍵詞：IRHOM2通過調(diào)控TNF-α影響小鼠肺纖維化的機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：肺纖維化是以彌漫性間質(zhì)纖維化為特征的一類疾病,其中50%以上原因不明,稱之為特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)。肺纖維化預(yù)后較差,治療不敏感,肺移植是目前終末期肺纖維化患者唯一有效的治療方法。肺纖維化致病機(jī)制不明,可能和肺損傷后炎癥反應(yīng)以及異常修復(fù)有關(guān)。肺纖維化是肺損傷的重要階段,肺損傷后的修復(fù)大致可分為三個(gè)階段：炎癥反應(yīng)期,肉芽組織生成和細(xì)胞外基質(zhì)沉積期,基質(zhì)重構(gòu)和肉芽組織分界期。損傷發(fā)生后,宿居的成纖維細(xì)胞活化,纖維細(xì)胞也被募集到損傷部位,并分化為平滑肌動(dòng)蛋白a (a-SMA)陽性的肌成纖維細(xì)胞,使細(xì)胞外基質(zhì)蛋白沉積,以促進(jìn)損傷修復(fù)和組織的完整性。有研究發(fā)現(xiàn)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞反復(fù)的損傷修復(fù),標(biāo)志性的出現(xiàn)在IPF患者和肺纖維化動(dòng)物模型中,纖維化標(biāo)記物a-SMA、I型膠原(collagen-Ⅰ)等表達(dá)上調(diào),同時(shí)上皮細(xì)胞骨架重建變?yōu)榧忓N形,最終轉(zhuǎn)化為間葉細(xì)胞。肺臟損傷修復(fù)的結(jié)果是纖維化還是恢復(fù)正常解剖結(jié)構(gòu),取決于肺泡內(nèi)滲出物及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白沉積能否有效清除,過多的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白沉積可導(dǎo)致組織纖維化。促炎性因子TNF-a在肺纖維中起關(guān)鍵作用。早先研究發(fā)現(xiàn),TNF-a參與肺損傷后修復(fù),在肺損傷后組織中高表達(dá),且與肺損傷程度相關(guān)。TNF-a可直接或間接通過受體,刺激胞外基質(zhì)沉積,并上調(diào)纖維化標(biāo)志物Ⅰ型膠原和a-SMA的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),TNF-a通過跨膜受體激酶,調(diào)控核內(nèi)靶基因的轉(zhuǎn)錄,在肺纖維化中引起肌成纖維細(xì)胞的增殖分化,是肺纖維化的重要致病途徑。非活性的菱形蛋白2(inactive rhomboid-like protein2, IRHOM2)屬于rhomboid蛋白家族,目前發(fā)現(xiàn)的rhomboid蛋白家族成員豐富,有十余種,參與細(xì)胞內(nèi)外的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),如rhomboid家族中的RHBDD3可抑制NK細(xì)胞TLR3通路的活化。Freeman等人研究發(fā)現(xiàn)IRHOM2是抗病原體防御和睡眠的調(diào)控蛋白。在微生物入侵時(shí),巨噬細(xì)胞等會(huì)分泌TNF-a,并且將其轉(zhuǎn)移到胞膜處,而后胞膜處的腫瘤壞死因子轉(zhuǎn)化酶(tumor necrosis factor-a converting enzyme, TACE)會(huì)促進(jìn)TNF-a的釋放。IRHOM2可以和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的TACE蛋白結(jié)合,促進(jìn)TACE離開內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到達(dá)胞膜發(fā)揮功能。所以,抑制IRHOM2蛋白表達(dá),可導(dǎo)致TACE無法成熟,不能發(fā)揮以上功能。另外,有研究表明Rhbdf2(編碼IRHOM2)敲除小鼠關(guān)節(jié)炎癥明顯減輕,關(guān)節(jié)腫脹減輕、臨床評分降低,滑液驗(yàn)證關(guān)節(jié)侵蝕減輕,說明IRHOM2在關(guān)節(jié)炎癥中的作用。因此,IRHOM2可能通過TNF-a信號通路調(diào)控小鼠肺纖維化。通過研究觀察博來霉素誘導(dǎo)的野生小鼠肺組織及肺細(xì)胞中IRHOM2變化,以及調(diào)控肺泡上皮細(xì)胞中IRHOM2來觀察上皮間質(zhì)化的程度,有利于闡明IRHOM2在肺纖維化中的作用機(jī)制,為臨床尋找干預(yù)肺纖維化提供新的線索和靶點(diǎn),為防治肺纖維化提供理論依據(jù)和臨床策略。第一部分小鼠肺纖維化對肺組織及細(xì)胞IRHOM2及TNF-a的影響小鼠肺纖維化對肺組織中IRHOM2及TNF-a的影響目的：建立小鼠肺纖維化模型,研究小鼠肺纖維化對肺組織中IRHOM2及TNF-a的影響方法：C57BL/6小鼠隨機(jī)分為2組(n=6),對照組(Con)、肺纖維化組(Fb)。模型組于第1天經(jīng)氣管給予鹽酸博來霉素(4mg/kg),對照組經(jīng)氣管給予生理鹽水(2ml/kg),第14天后取肺組織,通過心尖動(dòng)脈血?dú)夥治?肺葉組織HE及Masson病理學(xué)染色檢查,肺葉組織羥脯氨酸含量檢測,肺葉組織濕干重比,測定評估肺功能改變及小鼠肺纖維化程度,并收集小鼠肺泡灌洗液(BALF) ELISA測定TNF-a水平,免疫組化法染色測定Ⅰ型膠原(collagen-Ⅰ)、X平滑肌動(dòng)蛋白(a-SMA)、纖維連接蛋白(FN)在肺組織中含量,Western Blot方法檢測a-SMA、collagen-Ⅰ以及IRHOM2蛋白,進(jìn)一步評價(jià)IRHOM2及其他相關(guān)蛋白在小鼠肺纖維化中的表達(dá)情況。結(jié)果：與對照組相比,肺纖維化組給藥后第14天成功誘發(fā)小鼠肺纖維化,心尖部動(dòng)脈血氧分壓降低,肺泡結(jié)構(gòu)大面積實(shí)變,肺泡腔縮小,遍布成纖維細(xì)胞,Masson染色可見大量藍(lán)色膠原纖維,肺葉羥脯氨酸含量及濕干重比增加,肺泡灌洗液中TNF-a增加；免疫組化顯示collagen-Ⅰ、a-SMA和FN在肺組織中含量增加；Western Blot顯示小鼠肺纖維后肺組織IRHOM2蛋白含量降低collagen-Ⅰ和a-SMA增加。結(jié)論：鹽酸博來霉素致小鼠肺纖維化可以上調(diào)小鼠肺組織和肺泡灌洗液中TNF-a的含量,但I(xiàn)RHOM2蛋白水平降低。小鼠肺纖維化對Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞及肺泡巨噬細(xì)胞中IRHOM2及TNF-a的影響目的：小鼠肺纖維化對Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(AT-Ⅱ)和肺泡巨噬細(xì)胞(AM)中IRHOM2、TNFF-a的影響方法：C57BL/6小鼠隨機(jī)分為2組(n=6),對照組(Con)、肺纖維化組(Fb)。模型組于第1天經(jīng)氣管給予鹽酸博來霉素(4mg/kg),對照組經(jīng)氣管給予生理鹽水(2ml/kg),于第14天在戊巴比妥麻醉下,分離提取原代肺泡巨噬細(xì)胞和原代Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞,純化后細(xì)胞孵箱培養(yǎng)。1、肺泡巨噬細(xì)胞純化后ELISA檢測細(xì)胞和培養(yǎng)液中TNF-a的含量。2、原代Ⅱ型上皮細(xì)胞純化培養(yǎng)24 h后,檢測細(xì)胞和培養(yǎng)液中TNF-a的含量。3、Western Blot方法檢測原代肺泡巨噬細(xì)胞和原代Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中IRHOM2蛋白的含量變化。結(jié)果：與對照組相比,1、肺纖維化組小鼠肺泡巨噬細(xì)胞及其細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-a的含量增加。2、Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-a的水平降低。3、肺纖維化組小鼠肺泡巨噬細(xì)胞中IRHOM2蛋白水平增加,Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中IRHOM2蛋白水平降低。結(jié)論：小鼠肺纖維化可以上調(diào)肺泡巨噬細(xì)胞及培養(yǎng)液中TNF-a的含量,并使IRHOM2蛋白水平增加；同時(shí)下調(diào)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-a的含量,并使IRHOM2蛋白水平減少。第二部分引起Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中IRHOM2變化的主要因素及IRHOM2在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)中的作用目的：研究肺纖維化中,主要引起小鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中IRHOM2變化的原因,并研究IRHOM2蛋白在肺纖維化主要細(xì)胞機(jī)制——上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用。方法：C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4組(n=6),對照組(AT-Con)提取純化原代Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞,并用巨噬細(xì)胞純化后培養(yǎng)上清液培養(yǎng)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞；纖維化因子組(AT-Fb)用肺纖維化小鼠巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液培養(yǎng)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞；博來霉素組(AT-BLM)則在巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入博來霉素培養(yǎng)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞；TNF-a組(AT-TNF)則在巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入TNF-a培養(yǎng)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞。Western Blot方法檢測4組Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中IRHOM2含量的變化。培養(yǎng)人Ⅱ型肺泡上皮A549細(xì)胞系平均接種六孔板中分為3組(n=3),對照組(A-Con)為1640培養(yǎng)液；上皮間質(zhì)化組(A-EMT)在其1640培養(yǎng)液中加入鹽酸博來霉素,IRHOM2蛋白敲減組(A-RNAi)則為慢病毒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中IRHOM2蛋白明顯下調(diào),并在其1640培養(yǎng)液中加博來霉素培養(yǎng)。24 h后提取細(xì)胞蛋白, Western Blot方法檢測三組間代表上皮間質(zhì)化水平的collagen-Ⅰ和a-SMA含量。結(jié)果：培養(yǎng)24 h后Western Blot結(jié)果顯示,與對照組相比,博來霉素組Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中IRHOM2蛋白含量變化不明顯,而纖維化因子組及TNF-a組中Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中IRHOM2蛋白明顯降低。Western Blot檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,上皮間質(zhì)化組細(xì)胞中collagen-Ⅰ和a-SMA含量增加,IRHOM2蛋白敲減組間質(zhì)化程度介于對照組與上皮間質(zhì)化組之間。結(jié)論：提示參與改變肺泡上皮細(xì)胞中IRHOM2表達(dá)量的直接因素可能是肺纖維化小鼠巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中的炎性因子,而非博來霉素,并且在上皮間質(zhì)化細(xì)胞模型中,IRHOM2敲減可以下調(diào)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞EMT指標(biāo),提示可緩解纖維化程度。
【關(guān)鍵詞】：IRHOM2 TNF-α 肺纖維化 Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞 肺泡巨噬細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R563
【目錄】：

• 摘要5-9
• 縮略詞表9-10
• Abstract10-14
• 前言14-16
• 第一部分 小鼠肺纖維化對肺組織及細(xì)胞中IRHOM2和TNF-α的影響16-44
• 一、實(shí)驗(yàn)材料17-21
• 二、實(shí)驗(yàn)方法21-33
• 三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分組33
• 四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-44
• 第二部分 引起Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中IRHOM2變化的主要因素及IRHOM2在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)中的作用44-52
• 一、實(shí)驗(yàn)材料44-45
• 二、實(shí)驗(yàn)方法45-47
• 三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分組47-48
• 四、結(jié)果48-52
• 討論52-55
• 全文總結(jié)55-56
• 參考文獻(xiàn)56-61
• 文獻(xiàn)綜述61-68
• 參考文獻(xiàn)65-68
• 碩士在讀期間發(fā)表論文和參加科研工作情況68-69
• 致謝69

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  本文關(guān)鍵詞：IRHOM2通過調(diào)控TNF-α影響小鼠肺纖維化的機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：259678