發(fā)布時間：2017-03-21 13:06

  本文關(guān)鍵詞：IRHOM2通過調(diào)控TNF-α影響小鼠肺纖維化的機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：肺纖維化是以彌漫性間質(zhì)纖維化為特征的一類疾病,其中50%以上原因不明,稱之為特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)。肺纖維化預后較差,治療不敏感,肺移植是目前終末期肺纖維化患者唯一有效的治療方法。肺纖維化致病機制不明,可能和肺損傷后炎癥反應(yīng)以及異常修復有關(guān)。肺纖維化是肺損傷的重要階段,肺損傷后的修復大致可分為三個階段：炎癥反應(yīng)期,肉芽組織生成和細胞外基質(zhì)沉積期,基質(zhì)重構(gòu)和肉芽組織分界期。損傷發(fā)生后,宿居的成纖維細胞活化,纖維細胞也被募集到損傷部位,并分化為平滑肌動蛋白a (a-SMA)陽性的肌成纖維細胞,使細胞外基質(zhì)蛋白沉積,以促進損傷修復和組織的完整性。有研究發(fā)現(xiàn)Ⅱ型肺泡上皮細胞反復的損傷修復,標志性的出現(xiàn)在IPF患者和肺纖維化動物模型中,纖維化標記物a-SMA、I型膠原(collagen-Ⅰ)等表達上調(diào),同時上皮細胞骨架重建變?yōu)榧忓N形,最終轉(zhuǎn)化為間葉細胞。肺臟損傷修復的結(jié)果是纖維化還是恢復正常解剖結(jié)構(gòu),取決于肺泡內(nèi)滲出物及細胞外基質(zhì)蛋白沉積能否有效清除,過多的細胞外基質(zhì)蛋白沉積可導致組織纖維化。促炎性因子TNF-a在肺纖維中起關(guān)鍵作用。早先研究發(fā)現(xiàn),TNF-a參與肺損傷后修復,在肺損傷后組織中高表達,且與肺損傷程度相關(guān)。TNF-a可直接或間接通過受體,刺激胞外基質(zhì)沉積,并上調(diào)纖維化標志物Ⅰ型膠原和a-SMA的表達。進一步研究發(fā)現(xiàn),TNF-a通過跨膜受體激酶,調(diào)控核內(nèi)靶基因的轉(zhuǎn)錄,在肺纖維化中引起肌成纖維細胞的增殖分化,是肺纖維化的重要致病途徑。非活性的菱形蛋白2(inactive rhomboid-like protein2, IRHOM2)屬于rhomboid蛋白家族,目前發(fā)現(xiàn)的rhomboid蛋白家族成員豐富,有十余種,參與細胞內(nèi)外的信號轉(zhuǎn)導,如rhomboid家族中的RHBDD3可抑制NK細胞TLR3通路的活化。Freeman等人研究發(fā)現(xiàn)IRHOM2是抗病原體防御和睡眠的調(diào)控蛋白。在微生物入侵時,巨噬細胞等會分泌TNF-a,并且將其轉(zhuǎn)移到胞膜處,而后胞膜處的腫瘤壞死因子轉(zhuǎn)化酶(tumor necrosis factor-a converting enzyme, TACE)會促進TNF-a的釋放。IRHOM2可以和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的TACE蛋白結(jié)合,促進TACE離開內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到達胞膜發(fā)揮功能。所以,抑制IRHOM2蛋白表達,可導致TACE無法成熟,不能發(fā)揮以上功能。另外,有研究表明Rhbdf2(編碼IRHOM2)敲除小鼠關(guān)節(jié)炎癥明顯減輕,關(guān)節(jié)腫脹減輕、臨床評分降低,滑液驗證關(guān)節(jié)侵蝕減輕,說明IRHOM2在關(guān)節(jié)炎癥中的作用。因此,IRHOM2可能通過TNF-a信號通路調(diào)控小鼠肺纖維化。通過研究觀察博來霉素誘導的野生小鼠肺組織及肺細胞中IRHOM2變化,以及調(diào)控肺泡上皮細胞中IRHOM2來觀察上皮間質(zhì)化的程度,有利于闡明IRHOM2在肺纖維化中的作用機制,為臨床尋找干預肺纖維化提供新的線索和靶點,為防治肺纖維化提供理論依據(jù)和臨床策略。第一部分小鼠肺纖維化對肺組織及細胞IRHOM2及TNF-a的影響小鼠肺纖維化對肺組織中IRHOM2及TNF-a的影響目的：建立小鼠肺纖維化模型,研究小鼠肺纖維化對肺組織中IRHOM2及TNF-a的影響方法：C57BL/6小鼠隨機分為2組(n=6),對照組(Con)、肺纖維化組(Fb)。模型組于第1天經(jīng)氣管給予鹽酸博來霉素(4mg/kg),對照組經(jīng)氣管給予生理鹽水(2ml/kg),第14天后取肺組織,通過心尖動脈血氣分析,肺葉組織HE及Masson病理學染色檢查,肺葉組織羥脯氨酸含量檢測,肺葉組織濕干重比,測定評估肺功能改變及小鼠肺纖維化程度,并收集小鼠肺泡灌洗液(BALF) ELISA測定TNF-a水平,免疫組化法染色測定Ⅰ型膠原(collagen-Ⅰ)、X平滑肌動蛋白(a-SMA)、纖維連接蛋白(FN)在肺組織中含量,Western Blot方法檢測a-SMA、collagen-Ⅰ以及IRHOM2蛋白,進一步評價IRHOM2及其他相關(guān)蛋白在小鼠肺纖維化中的表達情況。結(jié)果：與對照組相比,肺纖維化組給藥后第14天成功誘發(fā)小鼠肺纖維化,心尖部動脈血氧分壓降低,肺泡結(jié)構(gòu)大面積實變,肺泡腔縮小,遍布成纖維細胞,Masson染色可見大量藍色膠原纖維,肺葉羥脯氨酸含量及濕干重比增加,肺泡灌洗液中TNF-a增加；免疫組化顯示collagen-Ⅰ、a-SMA和FN在肺組織中含量增加；Western Blot顯示小鼠肺纖維后肺組織IRHOM2蛋白含量降低collagen-Ⅰ和a-SMA增加。結(jié)論：鹽酸博來霉素致小鼠肺纖維化可以上調(diào)小鼠肺組織和肺泡灌洗液中TNF-a的含量,但IRHOM2蛋白水平降低。小鼠肺纖維化對Ⅱ型肺泡上皮細胞及肺泡巨噬細胞中IRHOM2及TNF-a的影響目的：小鼠肺纖維化對Ⅱ型肺泡上皮細胞(AT-Ⅱ)和肺泡巨噬細胞(AM)中IRHOM2、TNFF-a的影響方法：C57BL/6小鼠隨機分為2組(n=6),對照組(Con)、肺纖維化組(Fb)。模型組于第1天經(jīng)氣管給予鹽酸博來霉素(4mg/kg),對照組經(jīng)氣管給予生理鹽水(2ml/kg),于第14天在戊巴比妥麻醉下,分離提取原代肺泡巨噬細胞和原代Ⅱ型肺泡上皮細胞,純化后細胞孵箱培養(yǎng)。1、肺泡巨噬細胞純化后ELISA檢測細胞和培養(yǎng)液中TNF-a的含量。2、原代Ⅱ型上皮細胞純化培養(yǎng)24 h后,檢測細胞和培養(yǎng)液中TNF-a的含量。3、Western Blot方法檢測原代肺泡巨噬細胞和原代Ⅱ型肺泡上皮細胞中IRHOM2蛋白的含量變化。結(jié)果：與對照組相比,1、肺纖維化組小鼠肺泡巨噬細胞及其細胞培養(yǎng)液中TNF-a的含量增加。2、Ⅱ型肺泡上皮細胞培養(yǎng)液中TNF-a的水平降低。3、肺纖維化組小鼠肺泡巨噬細胞中IRHOM2蛋白水平增加,Ⅱ型肺泡上皮細胞中IRHOM2蛋白水平降低。結(jié)論：小鼠肺纖維化可以上調(diào)肺泡巨噬細胞及培養(yǎng)液中TNF-a的含量,并使IRHOM2蛋白水平增加；同時下調(diào)Ⅱ型肺泡上皮細胞培養(yǎng)液中TNF-a的含量,并使IRHOM2蛋白水平減少。第二部分引起Ⅱ型肺泡上皮細胞中IRHOM2變化的主要因素及IRHOM2在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)中的作用目的：研究肺纖維化中,主要引起小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞中IRHOM2變化的原因,并研究IRHOM2蛋白在肺纖維化主要細胞機制——上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用。方法：C57BL/6小鼠隨機分為4組(n=6),對照組(AT-Con)提取純化原代Ⅱ型肺泡上皮細胞和肺泡巨噬細胞,并用巨噬細胞純化后培養(yǎng)上清液培養(yǎng)Ⅱ型肺泡上皮細胞；纖維化因子組(AT-Fb)用肺纖維化小鼠巨噬細胞培養(yǎng)上清液培養(yǎng)Ⅱ型肺泡上皮細胞；博來霉素組(AT-BLM)則在巨噬細胞培養(yǎng)上清中加入博來霉素培養(yǎng)Ⅱ型肺泡上皮細胞；TNF-a組(AT-TNF)則在巨噬細胞培養(yǎng)上清中加入TNF-a培養(yǎng)Ⅱ型肺泡上皮細胞。Western Blot方法檢測4組Ⅱ型肺泡上皮細胞中IRHOM2含量的變化。培養(yǎng)人Ⅱ型肺泡上皮A549細胞系平均接種六孔板中分為3組(n=3),對照組(A-Con)為1640培養(yǎng)液；上皮間質(zhì)化組(A-EMT)在其1640培養(yǎng)液中加入鹽酸博來霉素,IRHOM2蛋白敲減組(A-RNAi)則為慢病毒轉(zhuǎn)染A549細胞,轉(zhuǎn)染后細胞中IRHOM2蛋白明顯下調(diào),并在其1640培養(yǎng)液中加博來霉素培養(yǎng)。24 h后提取細胞蛋白, Western Blot方法檢測三組間代表上皮間質(zhì)化水平的collagen-Ⅰ和a-SMA含量。結(jié)果：培養(yǎng)24 h后Western Blot結(jié)果顯示,與對照組相比,博來霉素組Ⅱ型肺泡上皮細胞中IRHOM2蛋白含量變化不明顯,而纖維化因子組及TNF-a組中Ⅱ型肺泡上皮細胞中IRHOM2蛋白明顯降低。Western Blot檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,上皮間質(zhì)化組細胞中collagen-Ⅰ和a-SMA含量增加,IRHOM2蛋白敲減組間質(zhì)化程度介于對照組與上皮間質(zhì)化組之間。結(jié)論：提示參與改變肺泡上皮細胞中IRHOM2表達量的直接因素可能是肺纖維化小鼠巨噬細胞培養(yǎng)液中的炎性因子,而非博來霉素,并且在上皮間質(zhì)化細胞模型中,IRHOM2敲減可以下調(diào)Ⅱ型肺泡上皮細胞EMT指標,提示可緩解纖維化程度。
【關(guān)鍵詞】：IRHOM2 TNF-α 肺纖維化 Ⅱ型肺泡上皮細胞 肺泡巨噬細胞
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R563
【目錄】：

• 摘要5-9
• 縮略詞表9-10
• Abstract10-14
• 前言14-16
• 第一部分 小鼠肺纖維化對肺組織及細胞中IRHOM2和TNF-α的影響16-44
• 一、實驗材料17-21
• 二、實驗方法21-33
• 三、實驗設(shè)計及分組33
• 四、實驗結(jié)果33-44
• 第二部分 引起Ⅱ型肺泡上皮細胞中IRHOM2變化的主要因素及IRHOM2在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)中的作用44-52
• 一、實驗材料44-45
• 二、實驗方法45-47
• 三、實驗設(shè)計及分組47-48
• 四、結(jié)果48-52
• 討論52-55
• 全文總結(jié)55-56
• 參考文獻56-61
• 文獻綜述61-68
• 參考文獻65-68
• 碩士在讀期間發(fā)表論文和參加科研工作情況68-69
• 致謝69

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張居馨;王士賢;李德華;;天仙丸—Ⅲ抑制化學物質(zhì)誘發(fā)的小鼠肺腺瘤作用的研究[J];中國腫瘤臨床;1991年05期

2 李文麗,海春旭,劉瑞,梁欣,張曉迪,王鵬;光氣染毒造成小鼠肺臟的氧化損傷[J];疾病控制雜志;2004年06期

3 展瑞;馮一中;顧振綸;張永勝;李強;曹志飛;楊曉彤;楊慶堯;郭次儀;周文軒;;復方蟲草對實驗性小鼠肺纖維化的干預作用及其機制研究[J];中國藥理學通報;2008年06期

4 胡旭,邱全瑛;胚芽滋養(yǎng)膠囊對流感病毒肺炎小鼠肺病理的影響[J];浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志;2004年06期

5 田華;姚樹桐;高鳳美;;含氫水對實驗性小鼠肺纖維化的抑制作用及機制[J];中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志;2012年02期

6 包信通;郭承軍;王鋒;;金銀花對流感小鼠肺損傷保護作用初探[J];時珍國醫(yī)國藥;2013年03期

7 章靜波;;二丁基羥甲苯促進小鼠肺腺瘤的形成[J];國外醫(yī)學(衛(wèi)生學分冊);1980年06期

8 王修杰,羅德元,王朝俊,肖邦良;小鼠肺腺癌的形態(tài)發(fā)生和組織化學觀察[J];華西醫(yī)科大學學報;1990年01期

9 封春玲,張月明,朱明,張衛(wèi)東,鐘承明;野薔薇果汁對烏拉坦誘發(fā)小鼠肺腺瘤的影響[J];營養(yǎng)學報;1993年01期

10 鐘華;韓寶惠;;小鼠肺部腫瘤集聚髓源性抑制細胞實驗研究[J];上海交通大學學報(醫(yī)學版);2010年09期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 楊雪峰;寧紅梅;葛亞明;徐之勇;趙恒章;葉幼榮;;鎘對發(fā)育期小鼠肺細胞DNA損傷的影響[A];全國動物生理生化第十二次學術(shù)交流會論文摘要匯編[C];2012年

2 喬文波;石磊;接亞敏;王春波;葛曉峰;鄂明艷;徐向英;尤慶山;;小鼠肺組織照射后不同時間的細胞因子[A];2007第六屆全國放射腫瘤學學術(shù)年會論文集[C];2007年

3 王莉;張偉京;;小鼠肺來源成纖維樣細胞改善博萊霉素誘導的小鼠肺傷[A];2007第六屆全國放射腫瘤學學術(shù)年會論文集[C];2007年

4 張海英;劉菲;劉志;;可溶性晚期糖基化終末產(chǎn)物受體對脂多糖致小鼠肺細胞凋亡的影響[A];中華醫(yī)學會急診醫(yī)學分會第十三次全國急診醫(yī)學學術(shù)年會大會論文集[C];2010年

5 黃山英;宋良文;劉濤;王清明;李楊;張勇;孫麗;;重組中國人γ-干擾素對小鼠肺損傷的防治作用[A];第六屆全國生物醫(yī)學體視學學術(shù)會議暨第九屆全軍軍事病理學學術(shù)會議、第五屆全軍定量病理學學術(shù)會議論文匯編[C];2005年

6 潘家華;樓皖玲;陳蘭舉;劉欣;;雙哌達莫和腺苷對小鼠肺纖維化的干預作用[A];加入WTO和中國科技與可持續(xù)發(fā)展——挑戰(zhàn)與機遇、責任和對策（下冊）[C];2002年

7 張艷;陳燕;陳平;彭紅;蔡珊;羅紅;吳尚潔;;經(jīng)腹腔注射香煙提取物建立小鼠肺氣腫模型[A];中華醫(yī)學會呼吸病學年會——2011（第十二次全國呼吸病學學術(shù)會議）論文匯編[C];2011年

8 余日安;魯文清;;硒對苯并[a]芘誘導的小鼠肺細胞DNA損傷的作用研究[A];武漢市首屆學術(shù)年會論文集[C];2004年

9 李文麗;海春旭;何偉;張曉迪;陳宏莉;李成剛;梁欣;秦緒軍;劉瑞;;光氣對小鼠肺臟的損傷作用[A];中國毒理學會第四屆全國學術(shù)會議論文（摘要）集[C];2005年

10 鄒葉強;孟婕;胡成平;歐陽斌;肖奇明;;支氣管肺泡灌洗術(shù)在小鼠肺纖維化模型中的應(yīng)用[A];中華醫(yī)學會第三屆全國間質(zhì)性肺病暨彌漫性泛細支氣管炎學術(shù)會議論文匯編[C];2010年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張宏亮;5-雜氮-2’-脫氧胞苷干預在腹腔注射香煙提取物所致小鼠肺氣腫模型中的作用及機制[D];中南大學;2013年

2 孫曉芳;三七總皂苷防治博萊霉素誘導小鼠肺纖維化的實驗研究[D];北京中醫(yī)藥大學;2011年

3 劉穎;固本止咳中藥對慢阻肺模型小鼠肺組織γδT細胞及其相關(guān)細胞因子影響的研究[D];北京中醫(yī)藥大學;2015年

4 王莉;小鼠肺間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)及對肺損傷的修復作用[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2007年

5 王聰慧;羧胺三唑抗博萊霉素誘導小鼠肺纖維化的作用及初步機制研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2012年

6 李進華;腺病毒感染對CSE腹腔注射肺氣腫小鼠肺部炎癥及凋亡的影響[D];中南大學;2014年

7 李久榮;IL-22對香煙誘導小鼠肺部炎癥的作用及戒煙后肺部炎癥的變化[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2014年

8 高曉玲;RNA干擾沉默TREM-2對內(nèi)毒素所致急性肺損傷小鼠肺泡巨噬細胞炎癥反應(yīng)的影響[D];山西醫(yī)科大學;2009年

9 呂學軍;Caveolin-1在LPS誘導AT-1細胞和小鼠肺部急性損傷中的作用及機制研究[D];第三軍醫(yī)大學;2010年

10 詹少鋒;益氣化痰方對慢性阻塞性肺疾病小鼠氣道炎癥及黏液分泌的調(diào)節(jié)機制研究[D];廣州中醫(yī)藥大學;2015年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李曉煥;茶多酚對熏煙致小鼠肺損傷保護機制研究[D];湖南農(nóng)業(yè)大學;2014年

2 盧坤琴;柴胡皂甙d對小鼠肺纖維化的作用及機制研究[D];江蘇大學;2010年

3 王光強;氧化型染發(fā)劑對小鼠肺氣腫的影響及機制初步探討[D];山東大學;2008年

4 彭婷;抑制EGFR-TGFβ正反饋環(huán)路緩解博來霉素致小鼠肺纖維化的研究[D];南方醫(yī)科大學;2014年

5 李遠奇;烏拉坦誘導小鼠肺癌變過程中l(wèi)ncRNA表達改變[D];廣州醫(yī)學院;2012年

6 黃藝娜;小鼠肺上皮過表達Noggin導致肺氣腫病癥[D];福建師范大學;2015年

7 顧P";不同艾煙環(huán)境對小鼠肺組織病理及抗氧化功能影響的研究[D];成都中醫(yī)藥大學;2011年

8 魏文坤;不同艾煙環(huán)境對小鼠肺組織及肺微循環(huán)影響的研究[D];成都中醫(yī)藥大學;2011年

9 陳菲;煙曲霉感染小鼠肺組織相關(guān)microRNA的篩選與鑒定[D];南方醫(yī)科大學;2014年

10 王倩;COPD小鼠肺組織中PRMT6的表達及意義[D];中南大學;2013年

  本文關(guān)鍵詞：IRHOM2通過調(diào)控TNF-α影響小鼠肺纖維化的機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號：259678