【摘要】：背景與目的： 根據(jù)世界衛(wèi)生組織公布的資料顯示，肺癌不論是發(fā)病率還是死亡率均居全球癌癥的首位，肺癌中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占80%左右，目前主要的治療措施有手術(shù)、放療、化療及生物治療等。雖然某些早期肺癌患者能達(dá)到治愈的效果，但是絕大部分患者被確診時(shí)已到中晚期，大部分失去了手術(shù)機(jī)會(huì)。近幾年來(lái)，中醫(yī)中藥對(duì)腫瘤影響得到了國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥界的關(guān)注，尤其是在中醫(yī)藥誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面具有重要意義。中西醫(yī)結(jié)合的方法治療腫瘤不論在臨床上還是在科研上都得到廣泛的應(yīng)用和推廣。補(bǔ)腎疏肝方是導(dǎo)師多年的經(jīng)驗(yàn)用方，在臨床上能使患者病灶范圍縮小，病情得到顯著控制，使患者的生活質(zhì)量得到明顯的提高，延長(zhǎng)患者的生存期限。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)血清藥理學(xué)的方法，基于“補(bǔ)腎疏肝方”治療非小細(xì)胞肺癌的臨床療效，進(jìn)一步探究該復(fù)方中藥對(duì)肺癌的療效及作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供更有利的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 選取60只SD大鼠均為雄性，采取隨機(jī)分配的原則，分為6組（每組10只，組間體重?zé)o差異）：分別是對(duì)照組、順鉑組、補(bǔ)腎疏肝方低、中、高劑量組、聯(lián)合組（補(bǔ)腎疏肝方中劑量聯(lián)合DDP）。中藥濃度的設(shè)置是根據(jù)灌胃藥物所用的劑量為正常成年人濃度的10倍。對(duì)照組的大鼠采用灌胃的方式給予4ml/天生理鹽水；DDP組的大鼠通過(guò)腹腔注射的方式每只給予2ml（0.5mg/ml）DDP，隔天給藥，共給藥3天；補(bǔ)腎疏肝方低劑量組的大鼠采用灌胃方式給予4ml/天的低劑量中藥（含生藥1.25g/ml共計(jì)5g）；補(bǔ)腎疏肝方中劑量組的大鼠通過(guò)灌胃給予中藥4ml/天（含生藥2.5g/ml共計(jì)10g）；補(bǔ)腎疏肝方高劑量組的大鼠通過(guò)灌胃給予中藥4ml/天（含生藥3.75g/ml共計(jì)15g）。聯(lián)合組給予中劑量灌胃藥液4ml/天灌胃及腹腔注射2ml的DDP（濃度0.5mg/ml），在第1、3、5天注射。最后一次灌胃2h后用10%水合氯醛腹腔注射的方式麻醉大鼠，從腹主動(dòng)脈采血保證無(wú)菌防治污染，，樣品靜置2h后，用離心機(jī)離心20min，3000r/min分離血清，在56℃的水浴箱中滅活30min，用0.22μm微孔過(guò)濾器過(guò)濾除菌，放在-20℃冰箱保存?zhèn)溆�。制備大鼠含藥血清，MTT法檢測(cè)補(bǔ)腎疏肝方含藥血清對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖的影響。Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)補(bǔ)腎疏肝方含藥血清對(duì)A549細(xì)胞凋亡率的影響。PI單染法流式細(xì)胞儀檢測(cè)補(bǔ)腎疏肝方含藥血清對(duì)A549細(xì)胞周期的影響。Western-Blot檢測(cè)補(bǔ)腎疏肝方含藥血清對(duì)P53，Bcl-2蛋白表達(dá)的影響。半定量RT-PCR檢測(cè)補(bǔ)腎疏肝方含藥血清對(duì)Notch信號(hào)通路的影響。 結(jié)果： 1.倒置顯微鏡下觀察，補(bǔ)腎疏肝方含藥血清作用A549細(xì)胞48h，可見(jiàn)對(duì)照組的A549細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好；而中劑量組的細(xì)胞變小，細(xì)胞間隙稍微增大，少部分細(xì)胞斷裂破碎，懸浮在培養(yǎng)液中。高劑量組多數(shù)細(xì)胞懸浮，少量貼壁細(xì)胞變圓形或斷裂成碎片，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，DDP組與高劑量組顯微鏡下大致相同。聯(lián)合組的細(xì)胞大量脫落、破碎，呈凋亡狀態(tài)。補(bǔ)腎疏肝方含藥血清作用于A549細(xì)胞72h后細(xì)胞凋亡最為顯著。 2. MTT法檢測(cè)不同濃度的補(bǔ)腎疏肝方含藥血清作用于A549細(xì)胞不同時(shí)間的抑制功能。結(jié)果顯示隨著補(bǔ)腎疏肝方含藥血清濃度的增加，處理時(shí)間的延長(zhǎng)，其抑制作用呈明顯的劑量-時(shí)間依賴(lài)效應(yīng)，與DDP聯(lián)合作用效果最為顯著，其24h，48h，72h聯(lián)合組的抑制率分別為26.71%、30.86%、41.74%。 3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)補(bǔ)腎疏肝方含藥血清作用于A549細(xì)胞72h細(xì)胞周期和凋亡率的改變：隨著補(bǔ)腎疏肝方含藥血清濃度的增加G2/M期細(xì)胞百分比增加，以聯(lián)合組G2/M期細(xì)胞百分比最高（P＜0.05）；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示不同濃度的補(bǔ)腎疏肝方含藥血清作用于A549細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞的凋亡率均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；聯(lián)合組與對(duì)照組比較有顯著差異（P0.01），凋亡率最高達(dá)38％。 4. Western Blot檢測(cè)補(bǔ)腎疏肝方含藥血清對(duì)P53，Bcl-2表達(dá)的影響。補(bǔ)腎疏肝方含藥血清作用于A549細(xì)胞72h不僅能激活P53還能下調(diào)凋亡抑制蛋白Bcl-2，以聯(lián)合組最為顯著。補(bǔ)腎疏肝方低、中、高、聯(lián)合組、DDP組與對(duì)照組BCL-2、P53灰度值比較均有差異（P＜0.05）。 5. RT-PCR法檢測(cè)補(bǔ)腎疏肝方含藥血清對(duì)Notch1、Delta4、VEGF mRNA的表達(dá)影響：補(bǔ)腎疏肝方含藥血清作用于A549細(xì)胞72h可抑制Notch1、Delta4、VEGF基因的表達(dá)， Notch1、Delta4、VEGF基因mRNA相對(duì)表達(dá)量結(jié)果顯示，高劑量組、DDP、聯(lián)合組與對(duì)照組比較有差異（P＜0.05），DDP組和聯(lián)合組對(duì)A549細(xì)胞的作用最明顯。 結(jié)論： 1．補(bǔ)腎疏肝方對(duì)A549細(xì)胞的抑制呈現(xiàn)時(shí)間-劑量依賴(lài)方式，以聯(lián)合組作用最為顯著。 2．補(bǔ)腎疏肝方阻滯非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞在G2/M期，減慢細(xì)胞的增殖速度，并誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。 3．補(bǔ)腎疏肝方可能是通過(guò)下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)量，激活P53蛋白表達(dá)量誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 4.補(bǔ)腎疏肝方誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡也可能與抑制Notch1、Delta4、VEGF基因表達(dá)有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2568941