【摘要】：骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是一種以軟骨退行性病變?yōu)橹饕±硖卣鞯穆躁P(guān)節(jié)疾病,是老年人群疼痛和致殘的主要原因。OA病因復(fù)雜,傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為主要由機(jī)械因素及年齡相關(guān)的軟骨退變所致。但近年來越來越多的證據(jù)顯示,代謝綜合征(]metabolic syndrome)與OA有密切聯(lián)系。流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn),OA患者的代謝綜合征發(fā)病率明顯增加。作為代謝綜合征的重要組成部分,糖尿病(Diabetes Mellitus, DM)與OA關(guān)系密切,并可能是OA發(fā)病的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn),非胰島素依賴型糖尿病患者更易患OA,且OA人群患糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)較對(duì)照組人群患糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)高。此外,有研究發(fā)現(xiàn),以鏈脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)誘導(dǎo)糖尿病,大鼠軟骨出現(xiàn)胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor1, IGF-1)抵抗,70天后滑膜結(jié)構(gòu)重塑,膠原沉積。這些研究均提示糖尿病與OA之間存在密切關(guān)聯(lián),而高血糖作為糖尿病最直接的表現(xiàn),其在糖尿病性O(shè)A發(fā)生發(fā)展中的作用目前鮮有報(bào)道。 OA不僅僅是關(guān)節(jié)軟骨的損傷,也可觀察到其它關(guān)節(jié)組織(如滑膜)的病理性改變。OA的初始表現(xiàn)大多是滑膜病變,這些病變一般要早于關(guān)節(jié)軟骨的X線或MRI的影像學(xué)表現(xiàn)�；ぱ着cOA的許多臨床癥狀相關(guān),可反映疾病的結(jié)構(gòu)性進(jìn)展�；ぱ椎膰�(yán)重程度可提示髕股關(guān)節(jié)軟骨病將如何進(jìn)展。由于一些可溶性介質(zhì)的活性,滑膜炎成為OA發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵因素。參與OA發(fā)病機(jī)制的兩個(gè)主要細(xì)胞因子,IL-1β和TNF,主要由活化的滑膜細(xì)胞、單核細(xì)胞和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞產(chǎn)生。此外,在OA進(jìn)程中,滑膜可產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)和聚集蛋白聚糖酶(aggrecanase),促進(jìn)軟骨基質(zhì)降解�；ぴ贠A發(fā)病中的重要作用及其作為治療靶標(biāo)的可能性已經(jīng)受到廣泛關(guān)注。 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum, ER)應(yīng)激是真核細(xì)胞在受到外界刺激時(shí)的一種保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng),通過誘導(dǎo)未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response, UPR)來進(jìn)行適應(yīng)性調(diào)節(jié),UPR則通過抑制蛋白的合成,誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白表達(dá)以此促進(jìn)蛋白折疊以及加速未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊的蛋白的降解來緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。研究表明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激偶聯(lián)炎癥反應(yīng)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),包括糖尿病和OA。OA軟骨的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白-78(Glucose regulation protein78,Grp78)和Bcl-2交互蛋白(Bc12-Interacting Protein-1,Bag-1)較正常軟骨表達(dá)增高。更有研究表明,細(xì)胞內(nèi)晚期糖基化終產(chǎn)物的聚集通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡。此外,有研究證明了關(guān)節(jié)炎滑膜和滑膜細(xì)胞高表達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因。 為證實(shí)糖尿病慢性高糖暴露可致OA,且滑膜內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用,本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)建立1型糖尿病和OA模型,并在細(xì)胞和分子水平證實(shí)高糖的損傷作用及其可能的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制,在整體和細(xì)胞水平證實(shí)我們的假說。 第一部分糖尿病大鼠OA易感現(xiàn)象 目的：流行病學(xué)調(diào)查和臨床試驗(yàn)研究提示糖尿病與OA關(guān)系密切,本部分?jǐn)M通過整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn),證實(shí)糖尿病大鼠關(guān)節(jié)軟骨質(zhì)量下降,長距離跑步刺激下OA易感現(xiàn)象。 方法：成年wistar雄性大鼠STZ(60mg/kg)一次性腹腔注射,2周后大鼠斷尾取血檢測糖尿病造模成功率。糖尿病造模成功大鼠正常飲食一月后,給予長距離跑步(每日以20m/mmin的速度跑55mmin,共6周,總跑步里程30Km)誘導(dǎo)OA。跑步結(jié)束后,異氟烷麻醉處死大鼠。取部分膝關(guān)軟骨節(jié)行墨汁染色,觀察大體形態(tài)改變并進(jìn)行軟骨大體形態(tài)評(píng)分。剩余膝關(guān)節(jié)組織固定、包埋、脫鈣切片后,行HE和番紅O染色,Ⅱ型膠原免疫組化,光鏡下觀察軟骨病理改變,并行OA的Mankin's評(píng)分。此外,膝關(guān)節(jié)滑膜行HE和MMP-13、NF-KB免疫組化。 結(jié)果：①糖尿病大鼠OA造模前后血糖變化：大鼠STZ腹腔注射后一周尾靜脈血糖為23.83±1.34mmol/L,對(duì)照組血糖為5.90+1.34mmo1/L,兩組間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P0.01),糖尿病造模成功率100%；跑步6周后,糖尿病組大鼠血糖為32.16+1.14mmol/L,對(duì)照組血糖為7.19±0.47mmo1/L,糖尿病大鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中均處于高血糖狀態(tài)；②關(guān)節(jié)軟骨大體改變及評(píng)分：與對(duì)照組相比,正常大鼠接受跑步刺激后,其關(guān)節(jié)軟骨大體形態(tài)正常,關(guān)節(jié)表面較光滑；糖尿病大鼠接受跑步刺激后,其關(guān)節(jié)軟骨表面出現(xiàn)較嚴(yán)重磨損,行墨汁染色后發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨表面明顯毛糙,糖尿病組軟骨大體評(píng)分均較對(duì)照組明顯升高(P0.01)；③關(guān)節(jié)軟骨病理學(xué)改變及評(píng)分：跑步后大鼠膝關(guān)節(jié)石蠟切片行番紅0染色后發(fā)現(xiàn),對(duì)照組基質(zhì)染色明顯,表面出現(xiàn)輕度毛糙；與對(duì)照組相比,糖尿病組出現(xiàn)不同程度的軟骨表面缺損,軟骨基質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂,軟骨厚度變薄,基質(zhì)淡染,軟骨細(xì)胞數(shù)明顯減少；免疫組化示糖尿病鼠關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)降低。跑步誘導(dǎo)OA后,糖尿病組軟骨OA病理Mankin's評(píng)分升高至11.9分,較對(duì)照組(1.6分)明顯增高(P0.01)；④滑膜病理改變：糖尿病大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜襯里細(xì)胞層增厚,間質(zhì)細(xì)胞數(shù)增多,出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤,滑膜炎組織學(xué)評(píng)分明顯增高(P0.01),免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,MMP-13和NF-κB的蛋白表達(dá)顯著升高(P0.01)。 結(jié)論：糖尿病損傷大鼠關(guān)節(jié)軟骨和滑膜,在接受過量跑步負(fù)荷誘導(dǎo)OA后,膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)典型的OA病理改變,提示,糖尿病高糖狀態(tài)可致大鼠OA易感,滑膜炎可能參與糖尿病OA發(fā)生。 第二部分高糖通過損傷滑膜引起軟骨細(xì)胞病理變化 目的：本部分研究擬在細(xì)胞水平證實(shí)高糖對(duì)關(guān)節(jié)軟骨和滑膜的損傷作用及其相互作用機(jī)制。 方法：以不同濃度葡萄糖(10、20、30、40mM)分別處理大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和成纖維樣滑膜細(xì)胞(Fibroblast-Like Synoviocytes, FLS)3天和10天,實(shí)時(shí)定量PCR檢測細(xì)胞基質(zhì)合成(col2al、aggrecan)、基質(zhì)降解(MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4、 ADAMTS、 TIMP-1和TIMP-3),以及炎癥因子(IL-6/TNF-a)和凋亡相關(guān)基因(caspase-3、 caspase-8、 caspase-9和Bcl-2)的表達(dá)。檢測FLS培養(yǎng)液中MDA和SOD的改變。然后,以30mM葡萄糖處理FLS3天的細(xì)胞培養(yǎng)液刺激軟骨細(xì)胞3天,檢測軟骨細(xì)胞基質(zhì)合成、基質(zhì)降解、炎癥和凋亡改變。 結(jié)果：①對(duì)軟骨細(xì)胞：高糖刺激3天和10天對(duì)軟骨細(xì)胞的活力無明顯影響；3天時(shí)軟骨基質(zhì)合成相關(guān)基因col2al和aggrecan表達(dá)增加,10天時(shí)增加更為顯著；基質(zhì)降解重要基因在3天時(shí)顯著降低,但高糖刺激10則轉(zhuǎn)為升高；凋亡相關(guān)基因在3天和10天均未見明顯變化；IL-6和TNF-α在10天明顯升高。②對(duì)FLS：高糖刺激3天時(shí)對(duì)滑膜細(xì)胞活力有促進(jìn)作用,10天時(shí)轉(zhuǎn)為抑制：高糖處理3天時(shí)FLS促炎、降解和凋亡相關(guān)基因即明顯升高,并且升高的程度在高糖刺激10天時(shí)更為顯著；此外,高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)3天的FLS培養(yǎng)液上清中SOD含量呈葡萄糖濃度依賴性降低,MDA濃度依賴性升高。③滑膜培養(yǎng)液對(duì)軟骨細(xì)胞：30mM高糖的滑膜培養(yǎng)液培養(yǎng)軟骨細(xì)胞后,軟骨細(xì)胞基質(zhì)合成顯著下降,促基質(zhì)降解酶表達(dá)增強(qiáng),促炎因子IL-6和TNF-α顯著升高；凋亡相關(guān)基因均未見明顯變化。 結(jié)論：FLS較軟骨細(xì)胞更易受高糖損傷。高糖可能通過刺激FLS分泌炎癥和降解因子,從而引起軟骨細(xì)胞病理損害。氧化損傷可能參與了這一過程。 第三部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與高糖所致滑膜損傷 目的：擬在細(xì)胞分子水平,進(jìn)一步探討高糖損傷FLS的機(jī)制,證實(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與糖尿病性O(shè)A。 方法：①高糖誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激：高糖分別處理軟骨細(xì)胞和FLS24/48/72小時(shí),檢測細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志基因表達(dá)；②內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激效應(yīng)的證實(shí)：實(shí)驗(yàn)分四組,正常對(duì)照組(10mM葡萄糖)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)組(10mM葡萄糖+內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑衣霉素5μg/m)、高糖對(duì)照組(30mM葡萄糖)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制組(30mM葡萄糖+內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-丁酸苯酯1mM),分別處理FLS2/4/8/16小時(shí),檢測滑膜細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、凋亡和基質(zhì)降解相關(guān)基因表達(dá)情況。 結(jié)果：①高糖誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和FLS內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激：軟骨細(xì)胞高糖處理24、48和72小時(shí)結(jié)果顯示,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志基因C/EBP同源蛋白(CCAAT-enhancer-binding protein homologous protein, CHOP)呈時(shí)間依賴性升高,升高在72小時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與對(duì)照組相比,NF-κB和生長靜止DNA損傷誘導(dǎo)基因34(growth arrest and DNA damage-inducible gene34,GADD34)在葡萄糖濃度20和30mM時(shí)出現(xiàn)顯著性升高;GRP78在20mM葡萄糖濃度處理72小時(shí)時(shí)升高。對(duì)于FLS,在30mM高糖處理24小時(shí)時(shí),所有檢測的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志基因的表達(dá)明顯上調(diào),而當(dāng)處理時(shí)間延長到48和72小時(shí)后,這些基因表達(dá)恢復(fù)至對(duì)照組水平。比較發(fā)現(xiàn),高糖誘導(dǎo)FLS應(yīng)激的強(qiáng)度明顯大于對(duì)軟骨細(xì)胞的強(qiáng)度。②衣霉素誘導(dǎo)FLS內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并出現(xiàn)類似高糖暴露的細(xì)胞損傷：與正常對(duì)照組相比,衣霉素處理組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志基因中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(mesencephalic astrocyte-deriVed neurotrophic factor,MANF)和GADD34出現(xiàn)時(shí)間依賴性升高,在處理8和16小時(shí)時(shí)升高具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；MMP-3、MMP-13和ADAMTS5升高,同時(shí)TIMP-1也明顯升高；caspase-3禾□caspase-9在衣霉素處理16小時(shí)明顯升高,caspase-8則在4小時(shí)明顯升高,Bcl-2則呈時(shí)間依賴性降低,降低在8和16小時(shí)具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；此外,葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(Glucose transporter,GLUT)-1在8和16小時(shí)明顯升高,同時(shí)伴有iNOS的升高(P0.05)。③4-丁酸苯酯抑制高糖所致的FLS內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及細(xì)胞炎癥降解改變：與高糖對(duì)照組相比,4-丁酸苯酯處理組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志基因顯著降低(P0.01)；MMP-3明顯降低,但同時(shí)TIMP-1也明顯降低(P0.01),MMP-13和ADAMTS-5無明顯改變；caspase-3呈時(shí)間依賴性降低,且降低在處理16小時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),抗凋亡基因Bcl-2升高,在4小時(shí)和8小時(shí)差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；此外,葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體GLUT-1在16小時(shí)明顯降低(P0.01)。 結(jié)論：高糖可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞和FLS內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,且對(duì)FLS的影響更為顯著。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)了高糖所致的FLS降解和凋亡等病理損傷。 綜上,糖尿病高血糖可誘導(dǎo)FLS內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激從而損傷滑膜,病變滑膜分泌炎癥和降解因子加劇高糖對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的損害,使關(guān)節(jié)軟骨質(zhì)量下降,長距離跑步刺激下OA易感。
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R587.1;R684.3

【參考文獻(xiàn)】

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1 張奉春;費(fèi)允云;;老年骨關(guān)節(jié)炎的診治進(jìn)展[J];實(shí)用老年醫(yī)學(xué);2008年01期

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本文編號(hào)：2568559