【摘要】：目的： 重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）發(fā)病兇險，死亡率極高，早期即會并發(fā)器官衰竭。急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是導致重癥急性胰腺炎患者早期高死亡率的主要原因，可以引起全身炎癥反應，甚至導致急性呼吸窘迫綜合癥（acute respiratory distresssyndro me，ARDS）而引起患者死亡。急性肺損傷在病理學上的表現(xiàn)為彌漫性肺微血管內皮損傷、肺泡上皮損傷、炎癥細胞（中性粒細胞、巨噬細胞等）的浸潤、肺出血、肺水腫等。細胞凋亡作為細胞生存與死亡的平衡點，在急性肺損傷的發(fā)病過程中發(fā)揮重要的作用。一方面急性肺損傷時中性粒細胞的大量凋亡可防止其過度釋放炎性因子，從而保護肺組織；另一方面，細胞凋亡途徑可同時誘導肺泡上皮細胞及肺微血管內皮細胞的凋亡，引起肺泡壁結構完整性的破壞，從而加重肺損傷的程度。肺泡Ⅱ型上皮細胞（alveolar type II epithelial cell，AECⅡ）是肺泡上皮的原始干細胞，不僅可以補充和分化成肺泡I型上皮細胞（alveolar typeI ep ithe lia l ce ll， AECI），起到修復肺組織損傷的作用，還可以合成、分泌肺表面活性物質，維持肺泡的穩(wěn)定性，保持肺泡表面水電解質的平衡，參與機體的免疫調節(jié)。在正常的肺組織中，肺泡上皮細胞可以通過自我更新，修復它正常的凋亡；而在急性肺損傷時，肺泡Ⅱ型上皮細胞成為最主要的損傷靶細胞其分化和凋亡都將受到影響。目前，關于肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡的研究，主要涉及到三條經(jīng)典細胞凋亡途徑（死亡受體途徑、線粒體途徑、內質網(wǎng)途徑），三條經(jīng)典細胞凋亡途徑之間既相互獨立又相互聯(lián)系。Fas觸發(fā)的死亡受體凋亡機制與早期細胞內Ca2+濃度的升高密切相關。鈣離子作為細胞內重要的第二信使，其超載可能在線粒體介導的細胞凋亡途徑中發(fā)揮重要作用。內質網(wǎng)是Ca2+的主要儲存庫，它的穩(wěn)態(tài)失衡可以活化Caspase-3而誘導細胞凋亡。 膜片鉗技術(patch-clamp technique)是一種以記錄通過離子通道的離子電流來反映細胞膜單一的或多個的離子通道分子活動的技術，目前被認為是研究離子通道的“金標準”，已成為研究離子通道的最重要的技術。該技術可以直接分辨出單個離子通道的電流，從而觀察該離子通道的開放和關閉的過程，用于檢測細胞內鈣離子濃度的變化與影響。 本研究通過制備SAP肺損傷大鼠模型，探究SAP相關性肺損傷的發(fā)病機理，研究在急性胰腺炎肺損傷時中藥清胰湯（Qingyitang）、鈣通道阻滯劑硝苯地平（Nifedipine）、抗炎藥物地塞米松（Dexamethasone）對肺泡Ⅱ型上皮細胞的凋亡及凋亡相關基因的表達、細胞內游離Ca2+的濃度、以及對炎性細胞因子表達水平的影響；利用膜片鉗技術觀察硝苯地平對脂多糖（LPS）處理的A549細胞鈣離子通道的電流影響。本研究將探究肺泡Ⅱ型上皮細胞內游離Ca2+的超載與肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡的相關性、肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡參與重癥急性胰腺炎肺損傷的發(fā)病機理、探討中藥清胰湯對重癥急性胰腺炎相關性肺損傷保護作用及機理，為臨床上應用中西醫(yī)結合方法有效提高重癥急性胰腺炎及其肺損傷的治療效果提供理論指導和實驗依據(jù)。 方法： 健康雄性SPF級SD大鼠，采用經(jīng)十二指腸乳頭內側胰膽管處注入15g/L脫氧膽酸鈉（so d ium d eo xyc ho la te）的方法制備S AP大鼠模型。60只SD大鼠隨機分為5組：模型組（Severe acute pancreatitis，SAP組）為脫氧膽酸鈉胰膽管注射組；假手術組（Sham-operation，SHAM組）為打開腹腔后，僅輕輕翻動胰腺；清胰湯治療組（QingYiTang，QYT組）、硝苯地平藥物處理組(Nifedipine,NIF組)和地塞米松處理組（Dexamethasone，DEX組）則在實驗大鼠造模之后給予相關的灌胃治療或尾靜脈藥物注射處理。實驗動物均于造模后24h用10%水合氯醛麻醉，留取血液和組織標本，分離、提取肺泡Ⅱ型上皮細胞，應用流式細胞儀（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測肺泡Ⅱ型上皮細胞的凋亡比例，用激光掃描共聚焦顯微鏡檢測肺泡Ⅱ型上皮細胞內的游離Ca2+濃度；RT-PCR檢測肺泡Ⅱ型上皮細胞Caspase-8及Bax凋亡基因的轉錄水平；用免疫組織化學方法檢測肺組織Caspase-8及Bax蛋白的表達情況；采用蛋白印跡（Western blot）法檢測肺組織Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白的表達情況；使用透射電鏡鑒定肺泡Ⅱ型上皮細胞并觀察細胞中線粒體超微結構的改變；肺組織和胰腺組織進行病理學切片、染色；用ABC-雙抗體夾心法（enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA）測定大鼠血清TNF-α的濃度；使用真空干燥法測量肺組織濕/干比值；采用全自動生化分析儀檢測大鼠血清淀粉酶的濃度并進行血氣分析。應用膜片鉗技術對不同濃度脂多糖（LPS）和硝苯地平處理的A549單個細胞進行全細胞模式檢測，記錄硝苯地平對Ca2+通道電流的影響。 結果： (1)與S HAM組相比，肺組織病理學檢測結果顯示模型組符合S AP相關性肺損傷的特征（SHAM組病理結果顯示無異常）；模型組肺組織濕/干比值顯著升高（P0.01）；模型組動脈PaO2顯著下降（P0.01）；模型組動脈PaCO2明顯上升（P0.01）；模型組實驗大鼠血清TNF-α和淀粉酶（amylase，AMY）含量顯著升高（P0.01）；透射電鏡觀察模型組肺泡Ⅱ型上皮細胞內線粒體的形態(tài)破壞嚴重，線粒體雙層膜結構模糊，線粒體腫脹、脊大量斷裂；FCM檢測模型組AECII凋亡率顯著上升（P0.01）；激光掃描共聚焦顯微鏡檢測模型組AECII內游離的Ca2+濃度顯著增大（P0.01）；反轉錄酶-聚合酶鏈鎖反應檢測模型組AECII中Caspase-8及BaxmRNA表達顯著增多（P0.01）；免疫組織化學法檢測模型組肺組織Caspase-8及Bax蛋白表達均顯著增多（P0.01）；蛋白印跡（Westernb lot）法檢測模型組肺組織Ba x、 Ca spas e-3、 Caspase-9相關凋亡蛋白表達顯著增加（P0.01），而在其它三個藥物治療組中各項檢測指標與SAP型組相比都有不同程度的降低，但與SHAM組相比各種檢測指標均有不同程度的增高；蛋白印跡（Western blot）法檢測模型組肺組織Bcl-2蛋白表達明顯下降（P0.01），而在其它三個藥物治療組中Bcl-2蛋白表達與SAP型組相比均有不同程度的升高，但與SHAM組相比Bcl-2蛋白表達有不同程度的下降。 （2）全細胞膜片鉗記錄結果表明：5μg/mL的LPS與對照組峰值電流比較無顯著變化（n=10，P㧐0.05）；10μg/mL的LPS與對照組峰值電流比較有顯著變化，峰值電流增大（n=10，P0.05）；15μg/mL的LPS與對照組峰值電流比較有顯著變化，，峰值電流減�。╪=10，P0.05）；硝苯地平對10μg/ml LPS處理的A549細胞鈣電流90%被阻斷，也進一步證明了此電流為鈣離子電流，并且對LPS刺激后的A549鈣電流有阻斷作用。 結論： (1)重癥急性胰腺炎時，AECII的過度凋亡直接參與S AP相關性ALI中肺組織的損害，且二者呈正相關關系。 (2)在重癥急性胰腺炎相關性急性肺損傷時，血清中TNF-α含量顯著升高，且與AECⅡ的凋亡指數(shù)呈正相關。 (3)研究顯示肺泡Ⅱ型上皮細胞內Ca2+的超載可促進肺泡Ⅱ型上皮細胞的凋亡。 (4)S AP相關性急性肺損傷時，肺泡Ⅱ型上皮細胞Caspas e-8及Ba x凋亡基因mRNA表達增多，且Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9相關凋亡蛋白表達顯著增加而肺組織Bcl-2蛋白表達顯著下降，由此死亡受體以及線粒體兩條凋亡途徑可能均在AECII的凋亡過程中扮演著重要的角色。 (5)應用中藥清胰湯、鈣離子拮抗劑硝苯地平、抗炎藥地塞米松可以明顯保護肺組織，抑制血清TNF-α的分泌、降低AECII的凋亡比例以及下調Caspase-8及BaxmRNA的表達，抑制肺組織Bax、Caspase-3、Caspase-8、 Casp ase-9相關凋亡蛋白的表達，促進Bc l-2蛋白的表達。 (6)當前臨床使用的單純西藥治療存在著作用單一、價格昂貴、藥物副作用等缺點，而使在SAP時的應用受到一定限制；隨著對SAP時肺損傷發(fā)病機制認識的不斷深入，中西醫(yī)結合治療可能成為防治SAP及其相關肺損傷的重要手段。 (7)膜片鉗技術離子通道電流檢測可以直接反應不同藥物處理后細胞離子通道通透性改變，對于揭示細胞電生理機制具有良好的應用價值。
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R285

【參考文獻】

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