【摘要】：目的： 重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）發(fā)病兇險(xiǎn)，死亡率極高，早期即會(huì)并發(fā)器官衰竭。急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是導(dǎo)致重癥急性胰腺炎患者早期高死亡率的主要原因，可以引起全身炎癥反應(yīng)，甚至導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合癥（acute respiratory distresssyndro me，ARDS）而引起患者死亡。急性肺損傷在病理學(xué)上的表現(xiàn)為彌漫性肺微血管內(nèi)皮損傷、肺泡上皮損傷、炎癥細(xì)胞（中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等）的浸潤(rùn)、肺出血、肺水腫等。細(xì)胞凋亡作為細(xì)胞生存與死亡的平衡點(diǎn)，在急性肺損傷的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。一方面急性肺損傷時(shí)中性粒細(xì)胞的大量凋亡可防止其過(guò)度釋放炎性因子，從而保護(hù)肺組織；另一方面，細(xì)胞凋亡途徑可同時(shí)誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞及肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，引起肺泡壁結(jié)構(gòu)完整性的破壞，從而加重肺損傷的程度。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞（alveolar type II epithelial cell，AECⅡ）是肺泡上皮的原始干細(xì)胞，不僅可以補(bǔ)充和分化成肺泡I型上皮細(xì)胞（alveolar typeI ep ithe lia l ce ll， AECI），起到修復(fù)肺組織損傷的作用，還可以合成、分泌肺表面活性物質(zhì)，維持肺泡的穩(wěn)定性，保持肺泡表面水電解質(zhì)的平衡，參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)。在正常的肺組織中，肺泡上皮細(xì)胞可以通過(guò)自我更新，修復(fù)它正常的凋亡；而在急性肺損傷時(shí)，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞成為最主要的損傷靶細(xì)胞其分化和凋亡都將受到影響。目前，關(guān)于肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡的研究，主要涉及到三條經(jīng)典細(xì)胞凋亡途徑（死亡受體途徑、線(xiàn)粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑），三條經(jīng)典細(xì)胞凋亡途徑之間既相互獨(dú)立又相互聯(lián)系。Fas觸發(fā)的死亡受體凋亡機(jī)制與早期細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的升高密切相關(guān)。鈣離子作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，其超載可能在線(xiàn)粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑中發(fā)揮重要作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是Ca2+的主要儲(chǔ)存庫(kù)，它的穩(wěn)態(tài)失衡可以活化Caspase-3而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 膜片鉗技術(shù)(patch-clamp technique)是一種以記錄通過(guò)離子通道的離子電流來(lái)反映細(xì)胞膜單一的或多個(gè)的離子通道分子活動(dòng)的技術(shù)，目前被認(rèn)為是研究離子通道的“金標(biāo)準(zhǔn)”，已成為研究離子通道的最重要的技術(shù)。該技術(shù)可以直接分辨出單個(gè)離子通道的電流，從而觀察該離子通道的開(kāi)放和關(guān)閉的過(guò)程，用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化與影響。 本研究通過(guò)制備SAP肺損傷大鼠模型，探究SAP相關(guān)性肺損傷的發(fā)病機(jī)理，研究在急性胰腺炎肺損傷時(shí)中藥清胰湯（Qingyitang）、鈣通道阻滯劑硝苯地平（Nifedipine）、抗炎藥物地塞米松（Dexamethasone）對(duì)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的凋亡及凋亡相關(guān)基因的表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+的濃度、以及對(duì)炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響；利用膜片鉗技術(shù)觀察硝苯地平對(duì)脂多糖（LPS）處理的A549細(xì)胞鈣離子通道的電流影響。本研究將探究肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+的超載與肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡的相關(guān)性、肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡參與重癥急性胰腺炎肺損傷的發(fā)病機(jī)理、探討中藥清胰湯對(duì)重癥急性胰腺炎相關(guān)性肺損傷保護(hù)作用及機(jī)理，為臨床上應(yīng)用中西醫(yī)結(jié)合方法有效提高重癥急性胰腺炎及其肺損傷的治療效果提供理論指導(dǎo)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 健康雄性SPF級(jí)SD大鼠，采用經(jīng)十二指腸乳頭內(nèi)側(cè)胰膽管處注入15g/L脫氧膽酸鈉（so d ium d eo xyc ho la te）的方法制備S AP大鼠模型。60只SD大鼠隨機(jī)分為5組：模型組（Severe acute pancreatitis，SAP組）為脫氧膽酸鈉胰膽管注射組；假手術(shù)組（Sham-operation，SHAM組）為打開(kāi)腹腔后，僅輕輕翻動(dòng)胰腺；清胰湯治療組（QingYiTang，QYT組）、硝苯地平藥物處理組(Nifedipine,NIF組)和地塞米松處理組（Dexamethasone，DEX組）則在實(shí)驗(yàn)大鼠造模之后給予相關(guān)的灌胃治療或尾靜脈藥物注射處理。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均于造模后24h用10%水合氯醛麻醉，留取血液和組織標(biāo)本，分離、提取肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測(cè)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的凋亡比例，用激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞內(nèi)的游離Ca2+濃度；RT-PCR檢測(cè)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞Caspase-8及Bax凋亡基因的轉(zhuǎn)錄水平；用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)肺組織Caspase-8及Bax蛋白的表達(dá)情況；采用蛋白印跡（Western blot）法檢測(cè)肺組織Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白的表達(dá)情況；使用透射電鏡鑒定肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞并觀察細(xì)胞中線(xiàn)粒體超微結(jié)構(gòu)的改變；肺組織和胰腺組織進(jìn)行病理學(xué)切片、染色；用ABC-雙抗體夾心法（enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA）測(cè)定大鼠血清TNF-α的濃度；使用真空干燥法測(cè)量肺組織濕/干比值；采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠血清淀粉酶的濃度并進(jìn)行血?dú)夥治�。�?yīng)用膜片鉗技術(shù)對(duì)不同濃度脂多糖（LPS）和硝苯地平處理的A549單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行全細(xì)胞模式檢測(cè)，記錄硝苯地平對(duì)Ca2+通道電流的影響。 結(jié)果： (1)與S HAM組相比，肺組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示模型組符合S AP相關(guān)性肺損傷的特征（SHAM組病理結(jié)果顯示無(wú)異常）；模型組肺組織濕/干比值顯著升高（P0.01）；模型組動(dòng)脈PaO2顯著下降（P0.01）；模型組動(dòng)脈PaCO2明顯上升（P0.01）；模型組實(shí)驗(yàn)大鼠血清TNF-α和淀粉酶（amylase，AMY）含量顯著升高（P0.01）；透射電鏡觀察模型組肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體的形態(tài)破壞嚴(yán)重，線(xiàn)粒體雙層膜結(jié)構(gòu)模糊，線(xiàn)粒體腫脹、脊大量斷裂；FCM檢測(cè)模型組AECII凋亡率顯著上升（P0.01）；激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)模型組AECII內(nèi)游離的Ca2+濃度顯著增大（P0.01）；反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈鎖反應(yīng)檢測(cè)模型組AECII中Caspase-8及BaxmRNA表達(dá)顯著增多（P0.01）；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)模型組肺組織Caspase-8及Bax蛋白表達(dá)均顯著增多（P0.01）；蛋白印跡（Westernb lot）法檢測(cè)模型組肺組織Ba x、 Ca spas e-3、 Caspase-9相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)顯著增加（P0.01），而在其它三個(gè)藥物治療組中各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)與SAP型組相比都有不同程度的降低，但與SHAM組相比各種檢測(cè)指標(biāo)均有不同程度的增高；蛋白印跡（Western blot）法檢測(cè)模型組肺組織Bcl-2蛋白表達(dá)明顯下降（P0.01），而在其它三個(gè)藥物治療組中Bcl-2蛋白表達(dá)與SAP型組相比均有不同程度的升高，但與SHAM組相比Bcl-2蛋白表達(dá)有不同程度的下降。 （2）全細(xì)胞膜片鉗記錄結(jié)果表明：5μg/mL的LPS與對(duì)照組峰值電流比較無(wú)顯著變化（n=10，P㧐0.05）；10μg/mL的LPS與對(duì)照組峰值電流比較有顯著變化，峰值電流增大（n=10，P0.05）；15μg/mL的LPS與對(duì)照組峰值電流比較有顯著變化，，峰值電流減小（n=10，P0.05）；硝苯地平對(duì)10μg/ml LPS處理的A549細(xì)胞鈣電流90%被阻斷，也進(jìn)一步證明了此電流為鈣離子電流，并且對(duì)LPS刺激后的A549鈣電流有阻斷作用。 結(jié)論： (1)重癥急性胰腺炎時(shí)，AECII的過(guò)度凋亡直接參與S AP相關(guān)性ALI中肺組織的損害，且二者呈正相關(guān)關(guān)系。 (2)在重癥急性胰腺炎相關(guān)性急性肺損傷時(shí)，血清中TNF-α含量顯著升高，且與AECⅡ的凋亡指數(shù)呈正相關(guān)。 (3)研究顯示肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞內(nèi)Ca2+的超載可促進(jìn)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的凋亡。 (4)S AP相關(guān)性急性肺損傷時(shí)，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞Caspas e-8及Ba x凋亡基因mRNA表達(dá)增多，且Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)顯著增加而肺組織Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下降，由此死亡受體以及線(xiàn)粒體兩條凋亡途徑可能均在AECII的凋亡過(guò)程中扮演著重要的角色。 (5)應(yīng)用中藥清胰湯、鈣離子拮抗劑硝苯地平、抗炎藥地塞米松可以明顯保護(hù)肺組織，抑制血清TNF-α的分泌、降低AECII的凋亡比例以及下調(diào)Caspase-8及BaxmRNA的表達(dá)，抑制肺組織Bax、Caspase-3、Caspase-8、 Casp ase-9相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)，促進(jìn)Bc l-2蛋白的表達(dá)。 (6)當(dāng)前臨床使用的單純西藥治療存在著作用單一、價(jià)格昂貴、藥物副作用等缺點(diǎn)，而使在SAP時(shí)的應(yīng)用受到一定限制；隨著對(duì)SAP時(shí)肺損傷發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)的不斷深入，中西醫(yī)結(jié)合治療可能成為防治SAP及其相關(guān)肺損傷的重要手段。 (7)膜片鉗技術(shù)離子通道電流檢測(cè)可以直接反應(yīng)不同藥物處理后細(xì)胞離子通道通透性改變，對(duì)于揭示細(xì)胞電生理機(jī)制具有良好的應(yīng)用價(jià)值。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R285

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2517991