發(fā)布時(shí)間：2019-05-22 02:29

【摘要】：研究背景 在骨損傷的臨床治療工作中,治療和預(yù)防大塊骨缺損以及術(shù)后骨不連,已經(jīng)成為骨科亟待解決的難題。傳統(tǒng)的植骨手術(shù)損傷大、骨量有限,需要一種創(chuàng)傷小、安全有效的方法來代替它,目前組織工程技術(shù)已成為解決骨不連和骨缺損的重要方法,采用間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)移植治療骨損傷已經(jīng)成為目前骨科學(xué)研究的熱點(diǎn),查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)MSCs以前的研究重點(diǎn)在于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs),對(duì)于人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUC-MSCs)研究較少,并且研究重點(diǎn)在于hUC-MSCs的培養(yǎng)、鑒定、誘導(dǎo)分化、基因修飾等體外實(shí)驗(yàn),對(duì)于hUC-MSCs移植的體內(nèi)作用機(jī)制研究文獻(xiàn)較少。 hUC-MSCs具有MSCs的一般特征“歸巢”,當(dāng)組織損傷后,引入體內(nèi)的外源性MSCs,趨于向損傷部位和炎癥組織轉(zhuǎn)移。在MSCs歸巢研究中發(fā)現(xiàn),在相關(guān)治療部位MSCs的檢出率低,存活率低,嚴(yán)重影響了MSCs對(duì)損傷組織的修復(fù)治療作用。目前對(duì)于MSCs向損傷部位或炎癥組織歸巢的具體機(jī)制尚不明確,總結(jié)影響MSCs歸巢的主要因素包括：組織損傷、移植途徑、移植時(shí)間、移植細(xì)胞數(shù)量、體外培養(yǎng)等。移植途徑中,動(dòng)脈移植有增加毛細(xì)血管閉塞的可能性,靜脈移植相對(duì)安全,由于移植細(xì)胞同時(shí)歸巢于肝肺脾等內(nèi)臟組織,歸巢率降低,局部移植能將MSCs直接注入靶器官周圍,但存在因缺血缺氧致細(xì)胞壞死可能,哪種移植途徑最安全最有效尚無定論。另外,關(guān)于體外培養(yǎng)對(duì)MSCs歸巢的影響研究發(fā)現(xiàn),通過體外MSCs擴(kuò)增,MSCs表面的趨化因子受體(C-X-C chemokine receptor, CXCR)減少,減弱了MSCs的歸巢能力。基因修飾能夠促進(jìn)移植MSCs存活、歸巢和分化,提高療效,但經(jīng)基因修飾的MSCs異位成骨并且成瘤風(fēng)險(xiǎn)升高,而作為目前最常用基因轉(zhuǎn)載工具的病毒,其安全性缺乏驗(yàn)證。成骨分化誘導(dǎo)作為一種體外培養(yǎng)的成熟技術(shù),是否提升hUC-MSCs的歸巢和存活能力,未發(fā)現(xiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。 目前體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)hUC-MSCs能夠分泌單核細(xì)胞趨化因子1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6, IL-6)、組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1、白細(xì)胞介素8(interleukin-8, IL-8)等多種細(xì)胞因子,這些細(xì)胞因子在損傷組織修復(fù)的各個(gè)階段發(fā)揮著重要作用,體外成骨誘導(dǎo)是否提高h(yuǎn)UC-MSCs在體內(nèi)的旁分泌功能,提高其在骨損傷部位的存活能力,促進(jìn)骨損傷修復(fù),查閱文獻(xiàn)未見相關(guān)報(bào)道。 骨損傷修復(fù)相關(guān)細(xì)胞因子中骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetie proteins, BMPs)在骨祖細(xì)胞向成骨細(xì)胞(Osteoblast, OB)分化過程中起決定作用,在骨修復(fù)的各個(gè)階段發(fā)揮著重要作用,是目前骨損傷修復(fù)研究中發(fā)現(xiàn)的最重要的一組細(xì)胞因子。當(dāng)發(fā)生骨損傷時(shí),受骨損傷信號(hào)刺激細(xì)胞外的BMPs與細(xì)胞膜表面的BMPs受體結(jié)合,激活受體,通過Smads蛋白傳遞信號(hào),激活MSCs增殖分化,新生細(xì)胞再產(chǎn)生BMPs,形成正反饋,調(diào)控骨修復(fù),因此骨損傷部位BMPs的濃度在一定程度上能夠反映該部位的愈合能力,本課題通過觀察對(duì)比骨損傷部位BMP-2的表達(dá),研究不同移植方式和誘導(dǎo)分化對(duì)hUC-MSCs提高骨愈合能力的影響。 hUC-MSCs移植治療骨損傷的效果主要取決于hUC-MSCs歸巢的數(shù)量和歸巢后hUC-MSCs對(duì)局部微環(huán)境的調(diào)節(jié)兩個(gè)方面,本課題采用Wistar大鼠制作骨損傷模型,采用靜脈移植、局部注射移植以及不同程度的成骨分化誘導(dǎo),觀察hUC-MSCs在骨損傷部位的歸巢、存活以及BMP-2的表達(dá)情況,探尋提高h(yuǎn)UC-MSCs歸巢能力和促進(jìn)骨損傷修復(fù)的方法。 目的 1.對(duì)比觀察靜脈移植、局部移植以及不同程度體外成骨分化誘導(dǎo),對(duì)hUC-MSCs歸巢和存活的影響,研究提高h(yuǎn)UC-MSCs歸巢存活能力的方法。 2.采用靜脈移植、局部移植以及不同程度體外成骨分化誘導(dǎo),對(duì)比觀察hUC-MSCs對(duì)骨損傷部位BMP-2表達(dá)的影響,研究hUC-MSCs移植提高骨愈合能力的方法。 方法 1. hUC-MSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定 取健康產(chǎn)婦足月剖腹產(chǎn)的胎兒臍帶組織,使用組織塊貼壁法分離獲得hUC-MSCs,使用含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的DMEM培養(yǎng)基,使用胰蛋白酶-EDTA消化液消化傳代,取第3代細(xì)胞,采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表型CD73. CD105. CD34. CD45的表達(dá),證實(shí)hUC-MSCs分離培養(yǎng)成功。 2. hUC-MSCs成骨分化誘導(dǎo)及鑒定 分別取第6代、第5代和第3代hUC-MSCs,去掉原培養(yǎng)液,加入成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)液(0.1μmol/L地塞米松、50μmol/L抗壞血酸、10mmol/L β-甘油磷酸鈉、10%FBS的DMEM培養(yǎng)液),成骨分化誘導(dǎo)3天、7天、14天后分別進(jìn)行細(xì)胞移植。 采用茜素紅S染色法鑒定：成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)3周后,4%多聚甲醛固定,0.1%茜素紅染色,顯微鏡下觀察,證實(shí)體外成骨誘導(dǎo)成功。 3.制作Wistar大鼠骨損傷模型 選用成年Wistar大鼠,采用腹腔注射麻醉,單側(cè)或雙側(cè)大腿去毛備皮,縱行切開軟組織顯露股骨遠(yuǎn)端,、采用無菌鋼鋸,橫行切割干骺端至髓腔,模擬股骨遠(yuǎn)端不全骨折,作為骨損傷模型。 4. hUC-MSCs在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)歸巢及存活觀察 小鼠抗人細(xì)胞核抗體(mouse anti-human nuclei monoclonal antibody,貨號(hào)MAB1281)是針對(duì)人細(xì)胞核的特異性抗體,本研究在靜脈或局部注射hUC-MSCs后特定時(shí)間切取損傷部位骨標(biāo)本,采用免疫組織化學(xué)技術(shù),特異性顯示hUC-MSCs,在顯微鏡下觀察細(xì)胞定植情況。 5. Wistar大鼠骨損傷部位BMP-2測定 BMP-2是骨愈合過程中關(guān)鍵性細(xì)胞因子,通過BMP-2的測定來評(píng)價(jià)損傷部位骨愈合的能力。本研究在靜脈或局部移植hUC-MSCs后特定時(shí)間切取損傷部位骨標(biāo)本,選用BMP-2特異性抗體(BA0585),采用免疫組織化學(xué)技術(shù)染色,顯示BMP-2表達(dá),在顯微鏡下觀察。 6.實(shí)驗(yàn)分組對(duì)比研究 在hUC-MSCs歸巢研究中,采用單側(cè)骨損傷模型,分為靜脈移植組和局部移植組,每組內(nèi)又分為未分化誘導(dǎo)組和體外成骨誘導(dǎo)3天組、7天組、14天組,另外采用雙側(cè)骨損傷模型,一側(cè)骨損傷處注射hUC-MSCs,對(duì)側(cè)注射生理鹽水作為對(duì)照,觀察雙側(cè)hUC-MSCs的定植。在骨損傷部位BMP-2表達(dá)的研究中,采用單側(cè)骨損傷模型,分為靜脈途徑組、局部注射組和空白對(duì)照組,前兩組內(nèi)又分為未誘導(dǎo)組、體外成骨誘導(dǎo)3天組、7天組和14天組。 7. hUC-MSCs移植對(duì)骨損傷模型大鼠全身炎癥反應(yīng)的影響 分為骨損傷模型細(xì)胞移植治療組、骨損傷模型未治療組、健康大鼠空白對(duì)照組。骨損傷模型細(xì)胞移植治療組大鼠在細(xì)胞移植后7天和14天,腹腔注射麻醉后自尾靜脈取靜脈血,骨損傷模型未治療組在相同時(shí)間點(diǎn)抽取靜脈血,空白對(duì)照組大鼠直接抽取靜脈血,送濟(jì)南市第四人民醫(yī)院檢驗(yàn)科檢查血常規(guī)項(xiàng)目,對(duì)比各組白細(xì)胞和紅細(xì)胞含量。 結(jié)果 1.細(xì)胞移植后7天,靜脈移植組標(biāo)本hUC-MSCs定植明顯少于局部注射組標(biāo)本,未進(jìn)行成骨分化誘導(dǎo)和體外成骨誘導(dǎo)3天、7天、14天移植各組標(biāo)本之間hUC-MSCs定植對(duì)比沒有顯著性差異,雙側(cè)骨損傷模型中,注射生理鹽水側(cè)標(biāo)本未發(fā)現(xiàn)hUC-MSCs定植。 2.細(xì)胞移植后14天,體外成骨誘導(dǎo)3天組和7天組hUC-MSCs存活沒有顯著性差異,但明顯多于未進(jìn)行體外誘導(dǎo)組和體外成骨誘導(dǎo)14天組,局部注射組hUC-MSCs存活明顯多于靜脈移植組。 3.在細(xì)胞移植后7天和14天,骨損傷模型細(xì)胞移植治療組和骨損傷模型未治療組大鼠外周靜脈血白細(xì)胞含量,各組之間無明顯差異,與空白對(duì)照組比較有顯著性差異。紅細(xì)胞含量各組之間沒有明顯差異。 4.細(xì)胞移植后7天,未進(jìn)行體外誘導(dǎo)和體外成骨誘導(dǎo)3天、7天、14天細(xì)胞移植各組標(biāo)本之間BMP-2陽性細(xì)胞數(shù)量沒有顯著性差異,靜脈移植組標(biāo)本BMP-2陽性細(xì)胞明顯少于局部注射組標(biāo)本,所有細(xì)胞移植組標(biāo)本BMP-2陽性細(xì)胞明顯多于未移植細(xì)胞組。 5.細(xì)胞移植后14天,體外成骨誘導(dǎo)3天組和7天組標(biāo)本之間BMP-2陽性細(xì)胞沒有顯著性差異,但明顯多于未進(jìn)行體外誘導(dǎo)組和體外成骨誘導(dǎo)14天組,局部注射組BMP-2陽性細(xì)胞明顯多于靜脈移植組,所有細(xì)胞移植組標(biāo)本BMP-2陽性細(xì)胞明顯多于未移植細(xì)胞組。 結(jié)論 1. hUC-MSCs在骨損傷部位的歸巢能力,局部移植途徑強(qiáng)于靜脈移植途徑,與體外成骨誘導(dǎo)無相關(guān)性。 2.體外成骨誘導(dǎo)有利于hUC-MSCs在體內(nèi)的存活,誘導(dǎo)3天和7天優(yōu)于誘導(dǎo)14天。 3. hUC-MSCs移植后能夠促進(jìn)骨損傷部位的BMP-2表達(dá),體外成骨誘導(dǎo)能夠加強(qiáng)該作用。 4.骨損傷部位BMP-2表達(dá)強(qiáng)度：移植成骨誘導(dǎo)3天和7天hUC-MSCs移植成骨誘導(dǎo)14天hUC-MSCs移植未成骨誘導(dǎo)hUC-MSCs未移植hUC-MSCs 5. hUC-MSCs移植治療大鼠骨損傷,不能抑制全身炎癥反應(yīng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R683

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 孟玲,劉國樹,曹豐,牛麗麗,高艷紅,張鵬,趙連旭,李艷華,裴雪濤;經(jīng)靜脈途徑移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)梗死心肌的可行性與安全性研究[J];中華老年心腦血管病雜志;2005年03期

2 周諾;黃旋平;江獻(xiàn)芳;宋繼傳;李華;謝慶條;;骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2基因修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合對(duì)氧化聚乙烯和聚丙烯共聚物移植促進(jìn)兔下頜骨牽張成骨的實(shí)驗(yàn)研究[J];華西口腔醫(yī)學(xué)雜志;2013年03期

3 廖鋒;鄭揚(yáng);耿彬;唐朝樞;;促進(jìn)移植間充質(zhì)干細(xì)胞成骨的研究進(jìn)展[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2013年10期

4 王之允;董長和;楊敏云;白榮杰;;兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合生物衍生骨修復(fù)脛骨缺損[J];中國臨床康復(fù);2006年13期

5 杜志坡;貝抗勝;;干細(xì)胞在骨科疾病治療中的應(yīng)用[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2010年36期

6 張美榮;孫亞如;王麗;張學(xué)峰;胡建霞;周倩;高宏;王顏剛;;人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外分泌的傷口愈合相關(guān)因子[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2011年32期

7 李慧;顧健;林傳明;馬莉;沈連軍;吳蔚;汪中強(qiáng);;臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)CIA大鼠炎癥因子的干預(yù)[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2011年36期

8 曲志國;野向陽;林輝;崔正宏;;人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成骨及治療骨缺損[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2011年45期

9 李華濤;邊琳芬;吳勝剛;李強(qiáng);王黎麗;戴育成;劉洋;;臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)骨愈合的體外實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用1例[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2011年45期

10 于靚霞;陳芳;孫軍;王繼明;趙欽軍;任新軍;馬鳳霞;楊少光;韓之波;韓忠朝;;臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大鼠重癥肌無力的研究[J];中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志;2011年03期

，

本文編號(hào)：2482596