【摘要】：目的：清肝化瘀方是姚樹(shù)坤教授根據(jù)其三十余年臨床經(jīng)驗(yàn)創(chuàng)制的治療原發(fā)性肝癌的有效經(jīng)驗(yàn)方,該方具有清熱解毒,健脾祛濕,活血化瘀,軟堅(jiān)消ve等功效。前期臨床研究顯示,清肝化瘀方能夠提高患者免疫功能,延長(zhǎng)生存期,改善生活質(zhì)量,可應(yīng)用于大多數(shù)原發(fā)性肝癌患者,具有極高的開(kāi)發(fā)研究?jī)r(jià)值。清肝化瘀顆粒是通過(guò)優(yōu)化清肝化瘀方的制劑工藝而制成的顆粒劑。因此,本研究目的是評(píng)價(jià)清肝化瘀顆粒對(duì)二乙基亞硝胺(Diethylinitrosamine, DEN)致大鼠原發(fā)性肝癌的治療效果,并通過(guò)RafMEK/ERK通路和PI3K/Akt信號(hào)通路初步探討其分子作用機(jī)制。方法：SPF級(jí)健康雄性Wastar大鼠94只(體重190-210g),適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為空白組(n=10)、模型組(n=20)、清肝化瘀顆粒低劑量組(n=16)、清肝化瘀顆粒中劑量組(n=16)、清肝化瘀顆粒高劑量組(n=16)、去甲斑蝥素組(n=16)。除空白組外,其余各組大鼠均進(jìn)行腹腔注射DEN造肝癌模型。清肝化瘀顆粒低、中、高劑量組大鼠每天灌胃顆粒劑量分別為0.6g/Kg、1.2g/Kg、2.4g/Kg;去甲斑蝥素組大鼠每天灌胃去甲斑蝥素片劑量為3mg/Kg；空白組及模型組大鼠每天灌胃等體積生理鹽水,各組灌胃體積均為15m1/Kg。第16周末次灌胃給藥后禁食12小時(shí),麻醉大鼠腹主動(dòng)脈取血,處死大鼠取肝臟、脾臟并稱(chēng)重。檢測(cè)指標(biāo)包括：各組大鼠死亡率、腫瘤發(fā)生率、肝臟濕重、肝臟指數(shù)、脾臟濕重、脾臟指數(shù)；ALT, AST, GGT, ALP, AFU, TBA, IL-6, IL-10,IL-17等血清生化指標(biāo)；外周血T淋巴細(xì)胞亞群；免疫組化法及Western blot法檢測(cè)腫瘤組織中p-Akt、p-MEK、p-ERK、VEGF的表達(dá)；RT-PCR檢測(cè)檢腫瘤組織中AktmRNA、 RKIP mRNA、PTEN mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果：1清肝化瘀顆粒對(duì)DEN致大鼠原發(fā)性肝癌的抑制作用1.1清肝化瘀顆粒對(duì)肝癌大鼠生存率、腫瘤發(fā)生率、大鼠體重、肝脾指數(shù)的作用①大鼠生存率：模型組大鼠生存率為65%,清肝化瘀顆粒中劑量組大鼠生存率為100%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。②腫瘤發(fā)生率：模型組腫瘤發(fā)生率為100%,清肝化瘀顆粒低、中、高劑量組腫瘤發(fā)生率分別為100%、87.5%、100%,去甲斑蝥素組腫瘤發(fā)生率為93.8%,各組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。③大鼠體重：與模型組相比,清肝化瘀顆粒低、中、高劑量組及去甲斑蝥素組大鼠體重均顯著增加(p0.01)。④肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)：與模型組比,清肝化瘀顆粒中、高劑量組肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)均顯著降低(P0.01),去甲斑蝥素組肝臟指數(shù)亦顯著降低(P0.05)。1.2清肝化瘀顆粒對(duì)肝癌大鼠肝臟功能的改善作用與空白組相比,模型組大鼠血清ALT、AST、GGT、ALP、AFU、TBA顯著升高(p0.01)。與模型組相比,清肝化瘀顆粒低、中、高劑量組及去甲斑蝥素組均可顯著下調(diào)ALT、AST、GGT、ALP、AFU的表達(dá)水平(p0.01)；清肝化瘀顆粒中、高劑量組及去甲斑蝥素組還可顯著下調(diào)TBA的表達(dá)水平(p0.01或p0.05)。并且清肝化瘀顆粒中劑量組對(duì)上述指標(biāo)的改善作用顯著優(yōu)于去甲斑蝥素組(p0.01或p0.05)。1.3清肝化瘀顆粒對(duì)肝癌大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群及IL-6、IL-10、IL-17的作用與模型組相比,清肝化瘀顆粒低、中、高劑量組均可顯著上調(diào)大鼠外周血CD4+細(xì)胞數(shù)(p0.01或p0.05)；清肝化瘀顆粒中、高劑量組還可顯著上調(diào)CD4+/CD8+比值(p0.01或p0.05)。與空白組相比,模型組大鼠血清IL-6、IL-17顯著降低(P0.01)。與模型組相比,清肝化瘀顆粒低、中、高劑量組及去甲斑蝥素組均可顯著上調(diào)IL-6、IL-10的表達(dá)水平(P0.01)；清肝化瘀顆粒中、高劑量組及去甲斑蝥素組還可顯著上調(diào)IL-17的表達(dá)水平；并且清肝化瘀顆粒中、高劑量組對(duì)IL-6、IL-17上調(diào)作用顯著優(yōu)于去甲斑蝥素組(p0.01或p0.05)。2清肝化瘀顆粒作用的分子機(jī)制初探2.1清肝化瘀顆粒對(duì)Raf/MEK/ERK信號(hào)通路的作用通過(guò)免疫組化法和Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：與模型組相比,清肝化瘀顆粒中、高劑量組中p-MEK、p-ERK的表達(dá)均顯著降低(P0.01或P0.05)。RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：與模型組相比,清肝化瘀顆粒中劑量組RKIPmRNA的表達(dá)顯著升高(P0.05)。提示清肝化瘀顆�？赡芫哂幸种芌af/MEK/ERK信號(hào)通路的作用。2.2清肝化瘀顆粒對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的作用通過(guò)免疫組化法和Western blot法檢發(fā)現(xiàn)：與模型組相比,清肝化瘀顆粒低、中、高劑量組中p-Akt的表達(dá)顯著降低(P0.01或P0.05)。RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：與模型組相比,清肝化瘀顆粒中、高劑量組PTEN mRNA的表達(dá)顯著升高(P0.01)。提示清肝化瘀顆�？赡芫哂幸种芌 af/MEK/ERK信號(hào)通路的作用。結(jié)論：1.清肝化瘀顆粒對(duì)DEN致大鼠原發(fā)性肝癌有顯著抑制作用。2.清肝化瘀顆�？赡芫哂性鰪�(qiáng)肝癌大鼠免疫功能的作用。3.清肝化瘀顆�？赡苁峭ㄟ^(guò)抑制Raf/MEk/ERK 和 PI3K/Akt信號(hào)通路,發(fā)揮抗腫癌作用。4.清肝化瘀顆粒具有潛在臨床意義和開(kāi)發(fā)研究?jī)r(jià)值。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5

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本文編號(hào)：2460668