發(fā)布時(shí)間：2019-04-19 06:24

【摘要】：骨科臨床工作中經(jīng)常遇到關(guān)節(jié)軟骨的損傷,甚至是軟骨的缺損,其原因最常見為創(chuàng)傷,其他原因如感染、自身免疫、腫瘤等因素也可以引起各種關(guān)節(jié)表面疾患從而造成軟骨損傷。因此軟骨疾病是骨關(guān)節(jié)科臨床醫(yī)生最常面對的疾病之一,也是極為困難的課題之一。關(guān)節(jié)軟骨是由軟骨細(xì)胞、膠原和蛋白多糖的基質(zhì)組成,無血管、淋巴管及神經(jīng)支配。關(guān)節(jié)軟骨缺乏血管、軟骨細(xì)胞不能遷移、成熟軟骨細(xì)胞不能增值等都限制了修復(fù)反應(yīng),所以其自身修復(fù)能力極為有限。關(guān)節(jié)軟骨損傷甚至缺損后,將影響關(guān)節(jié)的正�；瑒�,引起疼痛、不穩(wěn)和關(guān)節(jié)功能障礙,加速關(guān)節(jié)的退變,導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生,嚴(yán)重的軟骨損傷遠(yuǎn)期可導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛,畸形等。負(fù)重關(guān)節(jié)如膝關(guān)節(jié)在關(guān)節(jié)炎晚期通常只能進(jìn)行人工關(guān)節(jié)置換術(shù)。能否在關(guān)節(jié)軟骨損傷的早期修復(fù)軟骨損傷?從而逆轉(zhuǎn)軟骨損傷,逆轉(zhuǎn)關(guān)節(jié)退變。因此軟骨損傷后的修復(fù)一直是創(chuàng)傷骨科和骨關(guān)節(jié)科的研究熱點(diǎn)。臨床上常用的鉆孔微骨折、關(guān)節(jié)鏡下刨削等治療方法雖能解決部分問題,但療效仍不十分滿意；自體軟骨組織移植是一種療效較為滿意的方法,但患者要在多承受一次手術(shù)創(chuàng)傷的同時(shí)還要犧牲一部分自體正常軟骨。上世紀(jì)80年代Robert Langer和Joseph P Vacanti首次提出”組織工程學(xué)”,為軟骨修復(fù)帶來了新的希望。組織工程學(xué)在軟骨修復(fù)上的應(yīng)用的核心是利用少量種子細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)擴(kuò)增,然后將擴(kuò)增后的活性細(xì)胞附著于特定的支架材料上,再移植到軟骨損傷區(qū)域而形成新的、健康的軟骨組織。組織工程學(xué)被認(rèn)為是最有可能解決軟骨損傷修復(fù)這一世界性難題的方法之一。 種子細(xì)胞是組織工程的關(guān)鍵,所以軟骨組織工程修復(fù)的種子細(xì)胞的選擇非常重要。采用自身軟骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞修復(fù)軟骨損傷的方法臨床效果較好,但是其缺點(diǎn)亦非常明顯,那就是要使用正常軟骨組織,取材困難、有限,且增加額外的損傷。因此,尋找更為合適的種子細(xì)胞就成了問題的關(guān)鍵。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)最早是在骨髓中發(fā)現(xiàn)的,隨著研究的深入相繼從臍血、胎盤、肌肉、血管、脂肪、皮膚等組織中提取出MSCs。間充質(zhì)干細(xì)胞是一種多能干細(xì)胞,為中胚層發(fā)育的早期細(xì)胞,具有多向分化的潛能。在一定條件誘導(dǎo)下,可分化成成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等,是組織工程理想的種子細(xì)胞。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymstem cells, BMSCs)是存在于骨髓中的具有高度自我更新能力和多向分化潛能的干細(xì)胞,可在適宜的條件下分化成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等,是組織工程理想的種子細(xì)胞,也是目前研究最廣的種子細(xì)胞。骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞可以定向分化為軟骨細(xì)胞,修復(fù)軟骨缺損。但是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞由于取材、安全性、倫理等問題限制了其應(yīng)用,而且BMSCs具有含量極少且分離成功率低等缺點(diǎn)。人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord blood-mesenchymal stem cells, hUCB-MSCs)是一類與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似的具有多向分化潛能的原始細(xì)胞,具有很強(qiáng)的定向分化和增殖能力。臍血間充質(zhì)干細(xì)胞具有以下優(yōu)點(diǎn)：獲取的侵襲性小；干細(xì)胞更原始,有更強(qiáng)的增殖分化能力；免疫原性弱；安全性較高；干細(xì)胞易于分離。目前臍血間充質(zhì)干細(xì)胞已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。本研究中聯(lián)合應(yīng)用密度梯度離心法和細(xì)胞貼壁法進(jìn)行分離、純化細(xì)胞并傳代,證實(shí)培養(yǎng)細(xì)胞為BMSCs和hUCB-MSCs。 骨形態(tài)發(fā)生蛋白(human bone morphogenetic protein, BMP)自上世紀(jì)六十年代被發(fā)現(xiàn)以來,一直是各國學(xué)者研究的熱點(diǎn)。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(human bone morphogenetic protein-2, BMP-2)是BMP的亞型,在有利于軟骨細(xì)胞生長的環(huán)境下,可誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化、增殖,并可維持軟骨細(xì)胞表型。由于BMP局部擴(kuò)散能力強(qiáng),單獨(dú)植入局部容易被組織液沖洗掉或被酶類降解,使其不能充分發(fā)揮生物學(xué)作用。這就需要一種能持久釋放BMP蛋白,維持蛋白濃度的技術(shù)來解決這個(gè)問題。所以BMP-2基因載入成為新的研究方向。本研究中使用脂質(zhì)體介導(dǎo)重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-hBMP-2基因轉(zhuǎn)染人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,探討能否有效轉(zhuǎn)染并促進(jìn)BMSCs和]hUCB-MSCs在體外向軟骨細(xì)胞分化。 目的 探討脂質(zhì)體介導(dǎo)重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-hBMP-2基因轉(zhuǎn)染人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并促進(jìn)其向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的可行性。 方法 1.臍血間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的采集、分離、培養(yǎng)、鑒定 選擇青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)產(chǎn)科3名30歲以下健康、無急慢性疾病、無傳染病、血傳檢測陰性的剖宮產(chǎn)婦采集臍血。新生兒產(chǎn)出后立即在距胎盤處鉗夾結(jié)扎臍帶并切斷,行臍帶靜脈穿刺直接將臍血引流入裝有枸櫞酸鈉的一次性采血袋內(nèi),共約30mL。 志愿者5人,均為男性,年齡24～36歲。因下肢骨折內(nèi)固定術(shù)后需行內(nèi)固定物取出術(shù)收住青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)創(chuàng)傷骨科。腰硬聯(lián)合麻醉結(jié)束后,內(nèi)固定取出手術(shù)前,用骨穿針在髂前上嵴穿刺抽取5ml骨髓。 使用密度梯度離心法和細(xì)胞貼壁聯(lián)合培養(yǎng)方法,分離間充質(zhì)干細(xì)胞,純化、培養(yǎng)、傳代。鏡下觀察,細(xì)胞純化后,用流式細(xì)胞儀檢測間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原。細(xì)胞高表達(dá)CD90, CD105, CD29,不表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)記CD34,CD45,確定所培養(yǎng)細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞。 2.重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-hBMP-2轉(zhuǎn)染臍血間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 選取P3細(xì)胞作為轉(zhuǎn)染細(xì)胞。加0.25%胰酶消化,1000r/min離心5min,加入含胎牛血清及青、鏈霉素雙抗的培養(yǎng)液進(jìn)行單細(xì)胞重懸,按照1×106/ml的細(xì)胞數(shù)接種到滅菌的六孔板內(nèi),每孔加入1ml重懸液,加含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液至3ml,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將已構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-hBMP-2和X-treme GENE轉(zhuǎn)染試劑解凍后,重組質(zhì)粒1000r/min離心5min。用無血清培養(yǎng)液稀釋達(dá)到1μg質(zhì)粒DNA/100ul培養(yǎng)液,混勻。取含有1μgDNA/100ul的稀釋液200ul,加入到1,2,3,4個(gè)無菌EP管內(nèi)。分別取6ulX-treme GENE加到上述前4個(gè)管中�；靹蚍跤�20min。觀察P3細(xì)胞融合度達(dá)80%以上時(shí)可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。加入不含F(xiàn)BS的DMEM/F12培養(yǎng)液1m1。2h后將混勻的DNA復(fù)合體分別加入孔中,加無血清培養(yǎng)液至2ml,繼續(xù)培養(yǎng)。8h后取出細(xì)胞,換含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液。每24h熒光顯微鏡下觀察一次,觀察培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞中增強(qiáng)綠色熒光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP)的表達(dá)情況。熒光采用488nm波長紫外光激發(fā)。計(jì)算48h時(shí)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率。 收集轉(zhuǎn)染后第3天間充質(zhì)干細(xì)胞及對照組細(xì)胞,提取細(xì)胞總RNA。使用PrimeScript RT-PCR Kit (TaKaRa公司)試劑盒反轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA。通過PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)結(jié)束后,產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳,電泳結(jié)束后用凝膠成像分析儀成像。 取轉(zhuǎn)染后14天間充質(zhì)干細(xì)胞及對照組細(xì)胞,按照每孔15×104的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行細(xì)胞爬片,固定,加入0.5%TritonX-100,溫育。加入封閉血清,溫育。先后加入1：50稀釋濃度兔抗人Ⅱ型膠原蛋白一抗、鼠抗兔二抗,溫育。加入DAB顯色。蘇木素復(fù)染。樹膠封片,顯微鏡下觀察。 結(jié)果 1.從人臍血及骨髓中分離出間充質(zhì)干細(xì)胞,經(jīng)密度梯度離心法與貼壁培養(yǎng)法結(jié)合分離、培養(yǎng)、傳代、純化、鑒定,經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、流式細(xì)胞儀檢測予以證實(shí)。兩種細(xì)胞生長略有不同。 2.使用重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-hBMP-2轉(zhuǎn)染臍血間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。RT-PCR檢測予以證實(shí)。通過EGFP計(jì)算轉(zhuǎn)染率分別為27.7%±7.59%和18.4%±5.94%,hUCB-MSCs的轉(zhuǎn)染率高于BMSCs。免疫組化檢測顯示兩種細(xì)胞Ⅱ型膠原蛋白均表達(dá)陽性。 結(jié)論 1.本研究成功的分離出臍血間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,經(jīng)培養(yǎng)、傳代、純化、鑒定證實(shí)為間充質(zhì)干細(xì)胞,并將其誘導(dǎo)為具有向軟骨細(xì)胞分化潛能的干細(xì)胞。 2.重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-hBMP-2基因可以有效轉(zhuǎn)染人臍血和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,目的基因可促進(jìn)細(xì)胞向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化。 創(chuàng)新性 1.目前無論是人BMSCs還是hUCB-MSCs,在BMP-2基因轉(zhuǎn)染方面研究較少,特別是hUCB-MSCs。本研究成功應(yīng)用重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-hBMP-2有效轉(zhuǎn)染入人臍血和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,并通過檢測證實(shí)。 2.本研究證實(shí)重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-hBMP-2可以促進(jìn)BMSCs以及hUCB-MSCs向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化。以期望本結(jié)果能為組織工程提供種子細(xì)胞,從而修復(fù)軟骨損傷。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 孫偉;胡亮;趙興;李官成;付炳方;潘頌華;;體外定向誘導(dǎo)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2010年07期

2 鄧方閣;張秀英;王心蕊;馬英智;李玉林;;體外模擬心肌微環(huán)境中人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化[J];吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2007年02期

3 徐曉良,同志勤,王坤正,牒軍,黨曉謙,徐德洪,高明宏;bBMP/膠原/珊瑚復(fù)合人工骨修復(fù)股骨頭骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究[J];骨與關(guān)節(jié)損傷雜志;2000年03期

4 陳華;李彬;溫昱;;3種方法修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損生物力學(xué)的研究[J];臨床骨科雜志;2006年03期

5 王志勇;余濟(jì)春;;BMP-2的研究現(xiàn)狀[J];實(shí)用臨床醫(yī)學(xué);2009年03期

6 李中華;欒保華;;體外誘導(dǎo)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究[J];山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2008年02期

7 張赫;李昂;饒國洲;周洪;;人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及成骨誘導(dǎo)活性[J];上�？谇会t(yī)學(xué);2010年03期

8 李悟;周仲毅;王忠華;王衛(wèi)東;張民;劉維永;金峰;;應(yīng)用犬骨髓間質(zhì)干細(xì)胞作為組織工程種子細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2009年05期

9 張勇剛;王黎明;楊明理;黃林;胡火珍;;自體血清培養(yǎng)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[J];生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志;2008年05期

10 崔玉明,胡蘊(yùn)玉,呂昌偉,呂榮;誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究[J];中國臨床康復(fù);2003年17期

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本文編號：2460679