【摘要】：骨科臨床工作中經(jīng)常遇到關節(jié)軟骨的損傷,甚至是軟骨的缺損,其原因最常見為創(chuàng)傷,其他原因如感染、自身免疫、腫瘤等因素也可以引起各種關節(jié)表面疾患從而造成軟骨損傷。因此軟骨疾病是骨關節(jié)科臨床醫(yī)生最常面對的疾病之一,也是極為困難的課題之一。關節(jié)軟骨是由軟骨細胞、膠原和蛋白多糖的基質組成,無血管、淋巴管及神經(jīng)支配。關節(jié)軟骨缺乏血管、軟骨細胞不能遷移、成熟軟骨細胞不能增值等都限制了修復反應,所以其自身修復能力極為有限。關節(jié)軟骨損傷甚至缺損后,將影響關節(jié)的正�；瑒�,引起疼痛、不穩(wěn)和關節(jié)功能障礙,加速關節(jié)的退變,導致骨關節(jié)炎的發(fā)生,嚴重的軟骨損傷遠期可導致關節(jié)疼痛,畸形等。負重關節(jié)如膝關節(jié)在關節(jié)炎晚期通常只能進行人工關節(jié)置換術。能否在關節(jié)軟骨損傷的早期修復軟骨損傷?從而逆轉軟骨損傷,逆轉關節(jié)退變。因此軟骨損傷后的修復一直是創(chuàng)傷骨科和骨關節(jié)科的研究熱點。臨床上常用的鉆孔微骨折、關節(jié)鏡下刨削等治療方法雖能解決部分問題,但療效仍不十分滿意；自體軟骨組織移植是一種療效較為滿意的方法,但患者要在多承受一次手術創(chuàng)傷的同時還要犧牲一部分自體正常軟骨。上世紀80年代Robert Langer和Joseph P Vacanti首次提出”組織工程學”,為軟骨修復帶來了新的希望。組織工程學在軟骨修復上的應用的核心是利用少量種子細胞經(jīng)體外培養(yǎng)擴增,然后將擴增后的活性細胞附著于特定的支架材料上,再移植到軟骨損傷區(qū)域而形成新的、健康的軟骨組織。組織工程學被認為是最有可能解決軟骨損傷修復這一世界性難題的方法之一。 種子細胞是組織工程的關鍵,所以軟骨組織工程修復的種子細胞的選擇非常重要。采用自身軟骨細胞作為種子細胞修復軟骨損傷的方法臨床效果較好,但是其缺點亦非常明顯,那就是要使用正常軟骨組織,取材困難、有限,且增加額外的損傷。因此,尋找更為合適的種子細胞就成了問題的關鍵。間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)最早是在骨髓中發(fā)現(xiàn)的,隨著研究的深入相繼從臍血、胎盤、肌肉、血管、脂肪、皮膚等組織中提取出MSCs。間充質干細胞是一種多能干細胞,為中胚層發(fā)育的早期細胞,具有多向分化的潛能。在一定條件誘導下,可分化成成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、心肌細胞、神經(jīng)細胞等,是組織工程理想的種子細胞。 骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymstem cells, BMSCs)是存在于骨髓中的具有高度自我更新能力和多向分化潛能的干細胞,可在適宜的條件下分化成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等,是組織工程理想的種子細胞,也是目前研究最廣的種子細胞。骨髓來源的間充質干細胞可以定向分化為軟骨細胞,修復軟骨缺損。但是骨髓間充質干細胞由于取材、安全性、倫理等問題限制了其應用,而且BMSCs具有含量極少且分離成功率低等缺點。人臍血間充質干細胞(human umbilical cord blood-mesenchymal stem cells, hUCB-MSCs)是一類與骨髓間充質干細胞相似的具有多向分化潛能的原始細胞,具有很強的定向分化和增殖能力。臍血間充質干細胞具有以下優(yōu)點：獲取的侵襲性�。桓杉毎�,有更強的增殖分化能力；免疫原性弱；安全性較高；干細胞易于分離。目前臍血間充質干細胞已成為國內外研究的熱點。本研究中聯(lián)合應用密度梯度離心法和細胞貼壁法進行分離、純化細胞并傳代,證實培養(yǎng)細胞為BMSCs和hUCB-MSCs。 骨形態(tài)發(fā)生蛋白(human bone morphogenetic protein, BMP)自上世紀六十年代被發(fā)現(xiàn)以來,一直是各國學者研究的熱點。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(human bone morphogenetic protein-2, BMP-2)是BMP的亞型,在有利于軟骨細胞生長的環(huán)境下,可誘導間充質干細胞向軟骨細胞分化、增殖,并可維持軟骨細胞表型。由于BMP局部擴散能力強,單獨植入局部容易被組織液沖洗掉或被酶類降解,使其不能充分發(fā)揮生物學作用。這就需要一種能持久釋放BMP蛋白,維持蛋白濃度的技術來解決這個問題。所以BMP-2基因載入成為新的研究方向。本研究中使用脂質體介導重組質粒pIRES2-EGFP-hBMP-2基因轉染人臍血間充質干細胞和骨髓間充質干細胞,探討能否有效轉染并促進BMSCs和]hUCB-MSCs在體外向軟骨細胞分化。 目的 探討脂質體介導重組質粒pIRES2-EGFP-hBMP-2基因轉染人臍血間充質干細胞和骨髓間充質干細胞并促進其向軟骨細胞轉化的可行性。 方法 1.臍血間充質干細胞和骨髓間充質干細胞的采集、分離、培養(yǎng)、鑒定 選擇青島市海慈醫(yī)療集團產科3名30歲以下健康、無急慢性疾病、無傳染病、血傳檢測陰性的剖宮產婦采集臍血。新生兒產出后立即在距胎盤處鉗夾結扎臍帶并切斷,行臍帶靜脈穿刺直接將臍血引流入裝有枸櫞酸鈉的一次性采血袋內,共約30mL。 志愿者5人,均為男性,年齡24～36歲。因下肢骨折內固定術后需行內固定物取出術收住青島市海慈醫(yī)療集團創(chuàng)傷骨科。腰硬聯(lián)合麻醉結束后,內固定取出手術前,用骨穿針在髂前上嵴穿刺抽取5ml骨髓。 使用密度梯度離心法和細胞貼壁聯(lián)合培養(yǎng)方法,分離間充質干細胞,純化、培養(yǎng)、傳代。鏡下觀察,細胞純化后,用流式細胞儀檢測間充質干細胞表面抗原。細胞高表達CD90, CD105, CD29,不表達造血干細胞表面標記CD34,CD45,確定所培養(yǎng)細胞為間充質干細胞。 2.重組質粒pIRES2-EGFP-hBMP-2轉染臍血間充質干細胞和骨髓間充質干細胞 選取P3細胞作為轉染細胞。加0.25%胰酶消化,1000r/min離心5min,加入含胎牛血清及青、鏈霉素雙抗的培養(yǎng)液進行單細胞重懸,按照1×106/ml的細胞數(shù)接種到滅菌的六孔板內,每孔加入1ml重懸液,加含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液至3ml,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將已構建好的重組質粒pIRES2-EGFP-hBMP-2和X-treme GENE轉染試劑解凍后,重組質粒1000r/min離心5min。用無血清培養(yǎng)液稀釋達到1μg質粒DNA/100ul培養(yǎng)液,混勻。取含有1μgDNA/100ul的稀釋液200ul,加入到1,2,3,4個無菌EP管內。分別取6ulX-treme GENE加到上述前4個管中。混勻孵育20min。觀察P3細胞融合度達80%以上時可進行轉染。加入不含F(xiàn)BS的DMEM/F12培養(yǎng)液1m1。2h后將混勻的DNA復合體分別加入孔中,加無血清培養(yǎng)液至2ml,繼續(xù)培養(yǎng)。8h后取出細胞,換含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液。每24h熒光顯微鏡下觀察一次,觀察培養(yǎng)間充質干細胞中增強綠色熒光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP)的表達情況。熒光采用488nm波長紫外光激發(fā)。計算48h時的細胞轉染率。 收集轉染后第3天間充質干細胞及對照組細胞,提取細胞總RNA。使用PrimeScript RT-PCR Kit (TaKaRa公司)試劑盒反轉錄RNA為cDNA。通過PCR擴增。PCR反應結束后,產物行瓊脂糖凝膠電泳,電泳結束后用凝膠成像分析儀成像。 取轉染后14天間充質干細胞及對照組細胞,按照每孔15×104的細胞數(shù)進行細胞爬片,固定,加入0.5%TritonX-100,溫育。加入封閉血清,溫育。先后加入1：50稀釋濃度兔抗人Ⅱ型膠原蛋白一抗、鼠抗兔二抗,溫育。加入DAB顯色。蘇木素復染。樹膠封片,顯微鏡下觀察。 結果 1.從人臍血及骨髓中分離出間充質干細胞,經(jīng)密度梯度離心法與貼壁培養(yǎng)法結合分離、培養(yǎng)、傳代、純化、鑒定,經(jīng)形態(tài)學觀察、流式細胞儀檢測予以證實。兩種細胞生長略有不同。 2.使用重組質粒pIRES2-EGFP-hBMP-2轉染臍血間充質干細胞和骨髓間充質干細胞。RT-PCR檢測予以證實。通過EGFP計算轉染率分別為27.7%±7.59%和18.4%±5.94%,hUCB-MSCs的轉染率高于BMSCs。免疫組化檢測顯示兩種細胞Ⅱ型膠原蛋白均表達陽性。 結論 1.本研究成功的分離出臍血間充質干細胞和骨髓間充質干細胞,經(jīng)培養(yǎng)、傳代、純化、鑒定證實為間充質干細胞,并將其誘導為具有向軟骨細胞分化潛能的干細胞。 2.重組質粒pIRES2-EGFP-hBMP-2基因可以有效轉染人臍血和骨髓間充質干細胞,目的基因可促進細胞向軟骨細胞轉化。 創(chuàng)新性 1.目前無論是人BMSCs還是hUCB-MSCs,在BMP-2基因轉染方面研究較少,特別是hUCB-MSCs。本研究成功應用重組質粒pIRES2-EGFP-hBMP-2有效轉染入人臍血和骨髓間充質干細胞,并通過檢測證實。 2.本研究證實重組質粒pIRES2-EGFP-hBMP-2可以促進BMSCs以及hUCB-MSCs向軟骨細胞轉化。以期望本結果能為組織工程提供種子細胞,從而修復軟骨損傷。
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R329.2

【參考文獻】

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本文編號：2460679