【摘要】：目的:通過《中藥新藥臨床指導原則》《中醫(yī)病證診斷療效標準》和多個版本《中醫(yī)婦科學》建立的更年期綜合征辨證標準的對比分析,以及學術(shù)界臨床辨證的全方位比較,闡明本病辨證失范的表現(xiàn)形式和成因,提出重新辨證規(guī)范的思路與方法;驗證來自傳統(tǒng)方劑文獻和臨床經(jīng)驗的干預更年期綜合征肝腎陰虛證中藥小復方——濟陰顆粒的藥效學,揭示本劑的作用機制,為后續(xù)新藥研制提供科學依據(jù)。材料與方法:1.女性更年期綜合征中醫(yī)辨證失范考察分析1.1對辨證標準文獻《中醫(yī)病證診斷療效標準》《中藥新藥臨床研究指導原則》和3個版本統(tǒng)編教材《中醫(yī)婦科學》辨證標準的異同進行比較分析。1.2檢索中國知網(wǎng)、重慶維普、CBM期刊數(shù)據(jù)庫近5年中醫(yī)臨床辨證治療更年期綜合征文獻,歸納統(tǒng)計學術(shù)界辨證離散程度,主證所屬癥狀構(gòu)成。1.3邏輯分析更年期綜合征辨證存在根本問題,闡明重新辨證規(guī)范的思路與方法。2.動物實驗部分2.1更年期綜合征造模方法2.1.1小鼠造模方法小鼠麻醉后將背部中線長毛剪除,切開皮膚和背部肌肉,結(jié)扎卵巢下輸卵管及脂肪,摘除雙側(cè)卵巢,后縫合傷口。腹腔注射青霉素連續(xù)3d。1周后對其進行陰道涂片,連續(xù)5d,未出現(xiàn)動情期的小鼠造模成功。2.1.2大鼠造模方法大鼠每日腹腔注射VCD溶液,連續(xù)60d后停藥。造模開始后第120d,所有大鼠(包括空白對照組10只)眼眶靜脈取血,檢測血清雌二醇(E2)含量,血清E2含量明顯低于空白對照組最低值的大鼠造模成功。2.2藥效學評價方法2.2.1小鼠自主活動檢測末次給藥30min后將小鼠放入自主活動箱內(nèi),適應5min后測定10min內(nèi)的活動次數(shù)。2.2.2小鼠閾下戊巴比妥鈉協(xié)同作用檢測末次給藥30min后各組小鼠腹腔注射30mg/kg戊巴比妥鈉,觀察并記錄15min內(nèi)翻正反射消失達1min以上的動物只數(shù)。2.2.3小鼠記憶能力檢測采用逐步引導方式訓練小鼠游出迷宮,訓練完成后記錄從起點到終點小鼠全程所花費的時間。2.2.4小鼠抗疲勞能力檢測以小鼠沉入水底10s為標記,記錄游泳時間。2.2.5其它采用ELISA方法檢測血清E2、FSH含量;通過光學顯微鏡進行卵巢、子宮形態(tài)學檢測;2.3濟陰顆粒作用機制研究采用免疫組化方法檢測卵巢細胞P53,Caspase-3,8,9,Bax,Bcl-2,Apaf-1蛋白的表達。采用熒光RT-PCR方法檢測AIF,Endo-G,Caspase-3,8,9,Bax,Bcl-2,Apaf-1 m RNA的表達。3數(shù)據(jù)分析方法采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行處理,計量數(shù)據(jù)以x±s表示,采用ONE-Way ANOVA及卡方檢驗進行分析,P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果:1.更年期綜合征辨證失范潛在問題與成因包括《標準》《原則》和不同版本《中醫(yī)婦科學》在內(nèi)的權(quán)威文獻,對更年期綜合征建立的辨證標準彼此有別,相差懸殊,各行其是。剔除重復,共得陰虛內(nèi)熱、陰虛精虧、腎精虧虛、陰虛肝旺、肝腎陰虛、陰虛血燥、心腎不交、腎陰虛、腎陽虛、脾腎兩虛、腎陰陽兩虛11證。近五年學術(shù)界對更年期綜合征臨床辨證,猛增至58證,保留了權(quán)威文獻中的9證,其余49證皆屬新增。足見更年期綜合征臨床辨證隨意性之強,離散度之大。而出現(xiàn)頻次最高的肝腎陰虛證和肝郁氣滯證的癥狀構(gòu)成分別為94和76種,遠遠超出本病實際出現(xiàn)癥狀的10數(shù)倍。如此嚴重的“證出多門”的混亂現(xiàn)象,與證名稱謂不規(guī)范,多證交叉重疊,同證異名有關(guān);與本病辨證標準的制訂互不通氣,各搞一套,缺乏統(tǒng)一協(xié)調(diào)有關(guān);同時與虛擬癥狀的大量羼入,進而抽象出眾多的虛擬之證有關(guān)。2.濟陰顆粒藥效學研究結(jié)果2.1濟陰顆粒對小鼠自主活動的影響空白對照組與假手術(shù)組小鼠自主活動無差別;模型組與空白對照組比較有顯著差異(P0.01),模型組小鼠自主活動劇烈;各給藥組與模型組比較,除濟陰顆粒低劑量組外均存在顯著性差異(P0.01),即除濟陰顆粒低劑量外其它藥物皆可有效降低小鼠自主活動;中藥對照組與濟陰顆粒高劑量組比較,在統(tǒng)計學上無顯著性差異(P0.05)。除西藥對照組外,各給藥組與空白對照組比較均存在顯著差異(P0.01)。2.2濟陰顆粒對閾下戊巴比妥鈉協(xié)同作用的影響空白對照組與假手術(shù)組小鼠在閾下戊巴比妥鈉干預下睡眠情況無差異。模型組與空白對照組比較有顯著差異(P0.01),模型組小鼠在閾下戊巴比妥鈉干預后無進入睡眠情況。與模型組比較,顯示濟陰顆粒能增加閾下劑量戊巴比妥鈉小鼠的睡眠只數(shù),中、高劑量組與之存在統(tǒng)計學差異(P0.01),且與中藥對照藥效果相當。與空白對照組比較,治療組中除濟陰顆粒低劑量組外,各組與之無統(tǒng)計學差異。2.3濟陰顆粒對小鼠記憶能力的影響空白對照組與假手術(shù)組小鼠游離水迷宮所需時間無差異。模型組與空白對照組比較有顯著差異(P0.01),模型組小鼠花費時間明顯增加。與模型組比較,顯示濟陰顆粒能縮短小鼠困于水迷宮的時間,中、高劑量組與之存在統(tǒng)計學差異(P0.01),且與中藥對照藥效果相當。各給藥組與空白對照組比較,除濟陰顆粒低劑量組外,其它各組無差異。2.4濟陰顆粒對小鼠抗疲勞能力的影響模型組與空白對照組小鼠游泳時間比較有顯著差異,模型組小鼠堅持游泳時間顯著縮短(P0.01)。與模型組比較,顯示濟陰顆粒能延長小鼠游泳時間,中、高劑量組存在顯著學差異(P0.01),且與中藥對照藥效果相當。各給藥組與空白對照組比較均存在顯著差異(P0.01)。2.5濟陰顆粒對大鼠血清E2、FSH含量的影響與空白對照組比較,模型組血清E2含量明顯降低(P0.01),說明模型建造成功。與模型組比較,西藥、中藥對照組,濟陰顆粒各劑量組血清E2含量明顯提高,具有顯著差異(P0.01)。各給藥組與空白對照組比較,除西藥對照組外均存在顯著差異(P0.01)�？瞻讓φ战M與模型組比較,模型組血清FSH含量明顯升高(P0.01),表明模型建造成功。與模型組比較,各給藥組血清FSH含量均明顯下降(P0.01)。各給藥組與空白對照組比較,濟陰顆粒高劑量組和中藥對照組與之無差異,其余各組均存在顯著差異(P0.01)。2.6濟陰顆粒對大鼠卵巢、子宮重量指數(shù)的影響模型組與空白對照組,卵巢指數(shù)與子宮指數(shù)降低,皆存在明顯差異(P0.01)。與模型組比較,濟陰顆粒高劑量組、西藥對照組、中藥對照組卵巢指數(shù)明顯升高(P0.01),各給藥組子宮指數(shù)均有升高,存在顯著差異(P0.01)。各給藥組與空白對照組比較,濟陰顆粒低劑量組卵巢指數(shù)與之存在顯著差異(P0.01),其它各組無差異。各給藥組與空白對照組比較,子宮指數(shù)無差異。2.4濟陰顆粒對大鼠卵巢、子宮形態(tài)的影響空白對照組大鼠子宮內(nèi)膜正常,子宮外膜層、肌層和內(nèi)膜層清晰可見,腺體和毛細血管豐富,腺腔較大,結(jié)締組織較疏松;模型組大鼠子宮內(nèi)膜變薄,腺體和毛細血管較少,腺腔變小;經(jīng)藥物干預后,各治療組大鼠子宮內(nèi)膜明顯增厚,腺體和毛細血管明顯增多;其中西藥對照組大鼠子宮內(nèi)膜呈現(xiàn)過度增厚狀態(tài),子宮內(nèi)膜細胞水腫,排列稀松�？瞻讓φ战M大鼠卵巢中各級卵泡數(shù)量和形態(tài)正常,卵泡細胞核清晰可見,周圍由細胞構(gòu)成,可見清晰透明帶。模型組大鼠卵巢卵泡大部分不發(fā)育或發(fā)育不良,卵泡細胞結(jié)構(gòu)不清晰,細胞核消失,多程囊性結(jié)構(gòu)包裹細胞。經(jīng)藥物干預后,各治療組大鼠卵巢卵泡發(fā)育情況好轉(zhuǎn),各級卵泡數(shù)量增多,出現(xiàn)原始卵泡或成熟卵泡。3.濟陰顆粒作用機制研究3.1濟陰顆粒對Caspase依賴性細胞凋亡通路的影響3.1.1濟陰顆粒對大鼠卵巢細胞P53蛋白表達的影響與空白對照組比較,造模后大鼠卵巢細胞凋亡蛋白P53的表達明顯增加(P0.01)。中藥、西藥對照組和濟陰顆粒各劑量組卵巢細胞中P53蛋白的表達減少(P0.01),其中濟陰顆粒低劑量組的下調(diào)最為明顯。各給藥組與空白對照組比較,西藥對照組、濟陰顆粒中、高劑量組有顯著差異(P0.01),中藥對照組與濟陰顆粒低劑量組與之無統(tǒng)計學差異。3.1.2濟陰顆粒對大鼠卵巢細胞Caspase-8 m RNA和蛋白的影響模型組與空白對照組比較,caspase-8 m RNA和蛋白的表達顯著增強(P0.01)。與模型組比較,除西藥對照組外,各組caspase-8 m RNA和蛋白的表達均顯著下降。西藥對照組和模型組比較,caspase-8 m RNA表達無差異。與空白對照組m RNA表達情況比較,濟陰顆粒中劑量組無統(tǒng)計學差異。與空白對照組蛋白表達情況比較,中藥對照組和濟陰顆粒中劑量組與之無統(tǒng)計學差異。m RNA和蛋白表達趨勢基本一致。3.1.3濟陰顆粒對大鼠卵巢細胞Caspase-3 m RNA和蛋白的影響模型組與空白對照組比較,模型組caspase-3 m RNA和蛋白表達顯著上調(diào),存在統(tǒng)計學意義(P0.01)。與模型組比較,各給藥組caspase-3蛋白的表達均顯著減弱(P0.01);與模型比較,西藥對照組caspase-3 m RNA表達無差異,其它各給藥組皆有降低。與空白對照組比較,中藥對照組caspase-3 m RNA表達與之無差異;濟陰顆粒中劑量組蛋白表達與之無統(tǒng)計學差異。m RNA和蛋白表達趨勢基本一致。3.1.4濟陰顆粒對大鼠卵巢細胞Caspase-9 m RNA和蛋白的影響模型組與空白對照組比較,模型組Caspase-9 m RNA和蛋白的表達顯著上調(diào),有統(tǒng)計學意義(P0.01)。各治療組與模型組比較,Caspase-9 m RNA和蛋白的表達下調(diào),有顯著差異(P0.01)。與空白對照組比較濟陰顆粒高劑量組Caspase-9 m RNA表達與之無差異;西藥、中藥對照組,濟陰顆粒低劑量組Caspase-9蛋白表達與之無統(tǒng)計學差異,三者之間比較無差異。3.1.5濟陰顆粒對大鼠卵巢細胞Bcl-2 m RNA和蛋白的影響與空白對照組比較,模型組Bcl-2 m RNA和蛋白的表達明顯降低(P0.01)。與模型組比較,中藥對照藥,濟陰顆粒各劑量均可顯著上調(diào)Bcl-2 m RNA表達(P0.01),調(diào)節(jié)強度相當;濟陰顆粒中、高劑量組蛋白表達與之存在顯著差異;西藥對照藥對Bcl-2m RNA和蛋白表達無明顯上調(diào)作用。與空白對照組比較,各組Bcl-2 m RNA表達均有顯著差異,濟陰顆粒中劑量與高劑量組蛋白表達與之無差異。m RNA和蛋白表達的趨勢一致。3.1.6濟陰顆粒對大鼠卵巢細胞Bax m RNA和蛋白的影響與空白對照組比較,模型組Bax m RNA和蛋白的表達顯著增強(P0.01)。與模型組比較,各治療藥均可減弱卵巢細胞Bax m RNA表達;除濟陰顆粒低劑量組外,各給藥組Bax蛋白表達明顯降低。與空白對照組比較,西藥對照組Bax m RNA表達與之無差異,濟陰顆粒高劑量組Bax蛋白表達與之無差異。m RNA和蛋白表達的趨勢基本一致。3.1.7濟陰顆粒對大鼠卵巢細胞Apaf-1 m RNA和蛋白的影響與空白對照組比較,模型組Apaf-1 m RNA和蛋白的表達顯著增強(P0.01)。與模型組比較,濟陰顆粒各劑量組均可顯著降低Apaf-1 m RNA和蛋白的表達。與空白對照組比較,中藥對照組,濟陰顆粒各劑量組Apaf-1 m RNA表達與之無差異;各給藥組蛋白表達均存在顯著差異(P0.01)。3.2濟陰顆粒對Caspase非依賴性細胞凋亡通路的影響3.2.1濟陰顆粒對大鼠卵巢細胞AIF m RNA表達的影響與空白對照組比較,模型組卵巢細胞AIF m RNA表達明顯增強。與模型組比較,各治療藥均可減弱卵巢細胞AIF m RNA的表達。濟陰顆粒高劑量的下調(diào)作用最顯著。與空白對照組比較,各組均存在顯著差異。3.2.2濟陰顆粒對大鼠卵巢細胞Endo-G m RNA表達的影響與空白對照組比較,模型組卵巢細胞Endo-G m RNA表達明顯增強。與模型組比較,各中藥組均可減弱卵巢細胞Endo-G m RNA的表達。除西藥對照組外,各給藥組Endo-G m RNA表達與空白對照組無差異。西藥對照藥對Endo-G m RNA表達的降低無明顯影響。結(jié)論:1.對更年期綜合征重新辨證規(guī)范的思路與方法。應改變針對本病中西醫(yī)病名或主癥辨證規(guī)范的作法,圍繞協(xié)調(diào)統(tǒng)一的病名辨證規(guī)范;對稱謂不規(guī)范、交叉重疊、同證異名者,按照邏輯關(guān)系,結(jié)合病情,去偽存真,統(tǒng)一稱謂,刪繁就簡;剔除大量與病證診斷無關(guān)的癥狀,確定癥狀與證的從屬關(guān)系,結(jié)合臨床實際規(guī)范同癥異名、交叉重疊癥狀和舌脈象。在經(jīng)過必要“瘦身”后,建立客觀性較強的預調(diào)查量表,借以開展前瞻性流行病學調(diào)查研究。應克服以往普遍利用某一權(quán)威辨證標準事先給定諸證名稱和診斷標準的先驗作法,對采集信息聚類分析后,結(jié)合德爾菲法做出客觀判斷。2.針對去勢更年期綜合征小鼠,濟陰顆粒可有效降低其自主活動,增加閾下劑量戊巴比妥鈉小鼠的睡眠只數(shù),具有鎮(zhèn)靜安神的作用;可顯著縮短去勢更年期小鼠游出水迷宮的時間,提高小鼠記憶能力;延長小鼠游泳時間,提高小鼠抗疲勞能力。濟陰顆粒可有效升高更年期綜合征大鼠血清E2含量,同時降低FSH含量。改善更年期大鼠卵巢和子宮內(nèi)膜形態(tài),增加卵巢指數(shù)和子宮指數(shù),延緩卵巢衰老。因此,濟陰顆�？捎行Ц纳聘昶诰C合征表現(xiàn),對實驗性更年期綜合征有確切療效。3.濟陰顆�？山档透昶诰C合征大鼠卵巢細胞P53蛋白、Caspase-3 Caspase-8,Caspase-9,Bax,Apaf-1蛋白和m RNA的表達,增強卵巢細胞Bcl-2 m RNA和蛋白的表達,抑制Caspase依賴性細胞凋亡通路,從而抑制卵巢細胞凋亡。是濟陰顆粒干預更年期綜合征的作用機制。4.濟陰顆粒可下調(diào)卵巢細胞AIF m RNA與Endo-g m RNA的表達,抑制Caspase非依賴性細胞凋亡通路,從而抑制卵巢細胞凋亡。是濟陰顆粒干預更年期綜合征的作用機制。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：遼寧中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R285.5

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本文編號：2414571