【摘要】：背景： 骨轉(zhuǎn)移癌是晚期腫瘤常見(jiàn)的并發(fā)癥之一。臨床上以肺癌、乳腺癌、前列腺癌、等實(shí)體瘤最易出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移,占腫瘤骨轉(zhuǎn)移的85%[1]。原發(fā)性肺癌骨轉(zhuǎn)移占晚期肺癌患者的30-40%[21,主要分布在肋骨、脊柱、骨盆以及四肢骨等部位。絕大部分為溶骨性破壞,少數(shù)呈成骨性破壞。由于骨質(zhì)和骨膜破壞,常造成局部疼痛,骨和關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)障礙,病理性骨折,高鈣血癥,從而使患者生存期的生活質(zhì)量明顯下降,原發(fā)性肺癌骨轉(zhuǎn)移患者的中位生存時(shí)間約為8-10個(gè)月[3]。目前在于骨轉(zhuǎn)移癌病人的治療上面仍無(wú)顯著有效的方案,多采用綜合治療方法,包括全身性化療、局部放射、內(nèi)分泌治療及放射性同位素等,均是針對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用。而對(duì)骨質(zhì)起作用藥物甚少的,僅有雙麟酸鹽用于抑制破骨細(xì)胞而起到治療作用,有學(xué)者研究雙磷酸鹽能抑制破骨細(xì)胞,干預(yù)腫瘤細(xì)胞對(duì)骨的侵犯,減輕腫瘤引起的骨損傷[4]。目前用于促骨形成藥物PTH(1-34)具有良好的促骨形成作用,同時(shí)能改變骨微結(jié)構(gòu)。是否可以利用其促骨形成作用而延緩骨轉(zhuǎn)移癌對(duì)骨破壞,從而延緩病理性骨折的發(fā)生呢? 甲狀旁腺激素(Parathyroid Hormone, PTH)是一種促骨形成藥物[5],2002年美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市,2010年P(guān)TH(1-34)批準(zhǔn)進(jìn)入中國(guó)。已經(jīng)有大量研究表明間斷小劑量注射PTH(1-34)可明顯增加骨密度、改善骨微結(jié)構(gòu)、降低骨折風(fēng)險(xiǎn)[6,7]。目前PTH(1-34)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床,主要用來(lái)治療骨質(zhì)疏松癥[8,9]。 天然的PTH由84個(gè)氨基酸構(gòu)成(PTH(1-84)),與I型PTH受體(PTHR1)結(jié)合,N端的34個(gè)氨基酸殘基(PTH(1-34))具有與PTH(1-84)相同的PTHR1結(jié)合和激活功能。研究表明PTH調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的生成、轉(zhuǎn)化、增殖或凋亡等各個(gè)環(huán)節(jié)[10],對(duì)破骨細(xì)胞的作用是通過(guò)對(duì)成骨細(xì)胞的影響而間接達(dá)到的,其效應(yīng)受體是成骨細(xì)胞表面的Ⅰ型PTH受體(PTHR1)[11],從而激活PTHR1及其下游的多個(gè)信號(hào)途徑而實(shí)現(xiàn)對(duì)骨的調(diào)節(jié)。 因此能否將PTH(1-34)應(yīng)用于骨轉(zhuǎn)移癌病人,利用PTH(1-34)的促骨形成及對(duì)骨結(jié)構(gòu)的重建的作用,延緩病理性骨折發(fā)生,甚至延長(zhǎng)病人生存時(shí)間,成為我們實(shí)驗(yàn)的初步思路,而實(shí)現(xiàn)這個(gè)思路,建立一種動(dòng)物模型是我們?cè)囼?yàn)的基礎(chǔ)。 動(dòng)物模型的制備是腫瘤骨轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ),而骨轉(zhuǎn)移癌的動(dòng)物模型,常用已建立的人/動(dòng)物腫瘤細(xì)胞株種植于免疫缺陷動(dòng)物體內(nèi)而建立的。小鼠是公認(rèn)的藥物檢驗(yàn)最佳動(dòng)物選擇,目前關(guān)于小鼠骨轉(zhuǎn)移模型成熟,從其制作方法常分為三種：第一種通過(guò)血流播散制作的腫瘤骨轉(zhuǎn)移模型1、靜脈注射法：靜脈注射法與臨床上骨轉(zhuǎn)移產(chǎn)生機(jī)制不符,以前很少使用。但最近Teresa等[12]報(bào)道,將MDA-MB-231細(xì)胞株在裸鼠體內(nèi)連續(xù)多次傳代后,篩選出多株不同細(xì)胞克隆,給這些細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)染熒光素酶報(bào)告基因,通過(guò)活體成像技術(shù)發(fā)現(xiàn),B02克隆株與其它細(xì)胞克隆不同,該細(xì)胞株具有快速形成溶骨型骨轉(zhuǎn)移的能力。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)將B02通過(guò)小鼠尾靜脈注射后,10天即可形成明顯的骨轉(zhuǎn)移。2、心臟注射法：左心室注射法產(chǎn)生的骨轉(zhuǎn)移模型與腫瘤患者骨轉(zhuǎn)移灶無(wú)論在生長(zhǎng)狀況還是形態(tài)學(xué)上都非常相似,是目前最常用的方法之一。該模型不僅有許多優(yōu)點(diǎn),還符合Paget提出的“種子與土壤學(xué)說(shuō)”:腫瘤細(xì)胞充當(dāng)“種子”,骨髓腔微環(huán)境充當(dāng)“土壤”。支持該學(xué)說(shuō)的證據(jù)有：腫瘤細(xì)胞經(jīng)左心室注射后,一些細(xì)胞在骨微環(huán)境中選擇性生長(zhǎng)進(jìn)而形成骨轉(zhuǎn)移瘤；抑制溶骨反應(yīng)可以抑制轉(zhuǎn)移腫瘤的生長(zhǎng)。利用該方法制備的模型的缺點(diǎn)是引起腦、肺、腎上腺皮質(zhì)等的多發(fā)性轉(zhuǎn)移,還可造成某些實(shí)驗(yàn)鼠骨轉(zhuǎn)移尚未出現(xiàn)而因其它的轉(zhuǎn)移灶致死。第二種方法,局部骨內(nèi)注射制作骨轉(zhuǎn)移模型,該法將針尖直接刺透骨皮質(zhì),將移植腫瘤細(xì)胞注入脛骨或股骨的骨干。具有致瘤率高、制作方法簡(jiǎn)單、不受臟器轉(zhuǎn)移影響等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)是造成了骨皮質(zhì)和骨髓腔的損傷,且所制作的模型主要為骨干轉(zhuǎn)移,與臨床上常見(jiàn)的骨骺端轉(zhuǎn)移不同。骨內(nèi)注射方法常被用來(lái)制作成骨性或成骨/溶骨混合性骨轉(zhuǎn)移模型[13]。為研究骨轉(zhuǎn)移發(fā)生機(jī)制和藥物療效提供了一個(gè)極具價(jià)值的模型工具。第三種方法,腫瘤原位移植模型,原位移植是指將癌細(xì)胞或組織塊種植于小鼠胸壁的乳腺脂肪墊內(nèi)或前列腺組織從而發(fā)生骨轉(zhuǎn)移。用該方法形成的骨轉(zhuǎn)移模型保留了從腫瘤原發(fā)灶到骨轉(zhuǎn)移的完整過(guò)程,但該復(fù)制方法也存在缺點(diǎn),即與上述介紹的血流播散、骨內(nèi)注射等方法相比,骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生率偏低,且伴有其他臟器的轉(zhuǎn)移。因此若從成瘤高,瘤體容易觀察,不易受器官轉(zhuǎn)移影響方面考量,那么第二種動(dòng)物模型制備的方法適合應(yīng)用。 本研究在上述背景下,選擇建立小鼠肺癌骨轉(zhuǎn)移模型,并在此模型上間歇性小劑量皮下注射PTH(1-34),通過(guò)觀察小鼠全身X線、顯微CT、骨組織病理切片、血清ALP等指標(biāo),初步觀察PTH(1-34)對(duì)小鼠肺癌骨轉(zhuǎn)移瘤生長(zhǎng)的影響。 目的 建立肺癌骨轉(zhuǎn)移小鼠模型； 初步觀察甲狀旁腺激素PTH(1-34)對(duì)肺癌骨轉(zhuǎn)移瘤的影響。 方法 將30只4-6周齡BALB/c雌性小鼠,用人肺癌A549細(xì)胞懸液骨內(nèi)注射的方法制作脛骨近端肺癌骨轉(zhuǎn)移模型,7天后X線確定模型建立,隨機(jī)分成三組,一組注射甲狀旁腺素PTH(1-34)作為觀察組,一組注射等量溶解劑作為空白對(duì)照組,一組注射環(huán)磷酰胺作為陽(yáng)性對(duì)照組,每2天測(cè)體重一次及觀察右后肢瘤體生長(zhǎng)情況,給藥28天后處死小鼠,所有小鼠行X線及顯微CT檢查觀察腫瘤形態(tài)、大小,CT檢測(cè)脛骨局部骨密度及腫瘤體積,HE染色及免疫組織化學(xué)法觀察腫瘤形態(tài)及性質(zhì),檢測(cè)血清堿性磷酸酶濃度了解成骨情況。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)表示,采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,ALP、腫瘤體積及CT數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析做整體檢驗(yàn),兩兩比較采LSD-t檢驗(yàn),P0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1、荷瘤小鼠成模情況：本組造模小鼠30只,經(jīng)7天后X線檢查,全部成瘤。 2、三組小鼠體重的變化：在造模后35天的觀察期內(nèi),與對(duì)照組比較,觀察組小鼠體重在用選模后14天內(nèi)有輕度下降,后隨時(shí)間增長(zhǎng)逐漸增加,在造模21天后保持與對(duì)照組一至,環(huán)磷酰胺組在造模后14天內(nèi)體重也輕度下降,后體重增長(zhǎng)緩慢,在造模后35天時(shí)略低于對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組。(圖2) 3、血清中ALP活性水平：三組小鼠間血清基線相比,各組的ALP水平均有明顯升高,PTH(1-34)組ALP升高幅度大于對(duì)照組,兩組間差異有顯著性(p0.05), PTH (1-34)及對(duì)照組升高幅度均明顯大于環(huán)磷酰胺組,組間差異有顯著性(p0.05)。(圖3) 4、X線表現(xiàn)：三組均存在骨破壞,觀察組與對(duì)照組骨破壞嚴(yán)重,均見(jiàn)溶骨性破壞,脛骨近端明顯,其中對(duì)照組1只小鼠左脛骨骨折,而環(huán)磷酰胺組骨破壞明顯較輕,其中6只小鼠骨皮質(zhì)完整,腫瘤影響明顯小于前兩組。(圖4) 5、顯微CT表現(xiàn)：觀察組及對(duì)照組均存在脛骨平臺(tái)骨中度及重度的破壞,呈明顯的溶骨性表現(xiàn),皮質(zhì)破壞,髓腔充滿(mǎn)癌組織,大部分骨小梁消失。與臨床上肺癌骨轉(zhuǎn)移的表現(xiàn)是一致的[14],環(huán)磷酰胺組骨破壞輕到中度,部分骨皮質(zhì)仍完整,抑制骨腫瘤生長(zhǎng)明顯優(yōu)于觀察組及對(duì)照組(圖5)。利用CT軟件檢測(cè)骨腫瘤的體積(圖5),發(fā)現(xiàn)PTH(1-34)與對(duì)照組的骨腫瘤體積大小之間的差異無(wú)顯著性(p0.05),而兩組骨腫瘤的體積明顯大于環(huán)磷酰胺組,組間差異顯著(P0.05),提示PTH(1-34)不抑制轉(zhuǎn)移瘤的生長(zhǎng),但也并沒(méi)有促進(jìn)骨轉(zhuǎn)移瘤體積增長(zhǎng)的趨勢(shì)。檢測(cè)脛骨近端腫瘤灶局部骨密度(圖7),從Mean/Density of BV及BV/TV兩方面數(shù)據(jù)提示PTH(1-34)組骨密度大于對(duì)照組,組問(wèn)差異有顯著性,(p0.05),兩組骨密度降低幅度均明顯大環(huán)磷酰胺組,組間差異顯著(p0.05)。 結(jié)論 1、人肺癌A549細(xì)胞可以在BALB/c小鼠身上成功建立脛骨近端轉(zhuǎn)移癌模型,脛骨平臺(tái)下癌細(xì)胞懸液注射法的成瘤時(shí)間、大小一致,成瘤率高(本組100%),是研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等機(jī)制的較理想的動(dòng)物模型。 2、ALP是促骨形成生化指標(biāo),X線掃描,顯微CT掃描及骨組織病理切片是檢測(cè)腫瘤骨轉(zhuǎn)移的良好指標(biāo)： ①堿性磷酸酶(ALP)是評(píng)價(jià)骨形成的一個(gè)敏感指標(biāo)[15],三組小鼠造模后,轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞破壞骨質(zhì)將刺激成骨細(xì)胞增殖對(duì)其修復(fù)導(dǎo)致ALP升高,而觀察組使用小劑量PTH(1-34)進(jìn)一步刺激成骨細(xì)胞,進(jìn)一步促進(jìn)骨形成。 ②X線能觀察小鼠骨質(zhì)結(jié)構(gòu)的整體情況,能在麻醉下進(jìn)行活體X線掃描,利于在造模后不同時(shí)間點(diǎn)(造模1周及5周)對(duì)模型腫瘤照片觀察,早期用于觀察造模是否形成,后期能明確判斷下肢整體腫瘤生長(zhǎng)及破壞影像。 ③顯微CT掃描清晰顯示骨腫瘤形態(tài),骨質(zhì)破壞,骨小梁結(jié)構(gòu)及髓腔浸潤(rùn)情況,三維重建更直觀顯示腫瘤大小、形狀、范圍；利用CT自帶軟件測(cè)量腫瘤長(zhǎng)、短徑,通過(guò)公式體積=長(zhǎng)徑×短徑2計(jì)量腫瘤大小,能進(jìn)行腫瘤大小的比較及組間差異分析；分析Mean/Density of BV及BV/TV的數(shù)據(jù),BV及BV/TV是指示骨量及骨分?jǐn)?shù)的指標(biāo),組間兩兩比較,說(shuō)明組間的差異,表示局部骨量差異的情況。 ④病理學(xué)提示骨質(zhì)破壞、腫瘤細(xì)胞情況,免疫組化分辨腫瘤性質(zhì),區(qū)分原腫瘤或新生腫瘤。 3、綜合上述理論及結(jié)果數(shù)據(jù),我們得出這樣的結(jié)論,間斷小劑量注射甲狀旁腺激PTH(1-34)并不促進(jìn)小鼠肺癌骨轉(zhuǎn)移瘤的生長(zhǎng),但能增加轉(zhuǎn)移瘤灶周?chē)墓橇俊?br/>[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R738.1;R734.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2408095