【摘要】：研究目的 腦缺血再灌注后血腦屏障通透性增加導(dǎo)致腦水腫,引起腦組織的繼發(fā)性損傷。本論文探索了線栓法制作大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞腦缺血再灌注模型,并探討了針刺百會(huì)、足三里穴對(duì)腦缺血再灌注損傷后血腦屏障破壞的保護(hù)作用機(jī)制,為針刺治療缺血性腦血管病的研究提供進(jìn)一步的科學(xué)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法 隨機(jī)數(shù)字表法將健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、電針組和藥物組。其中后三組根據(jù)再灌注時(shí)間分為1d、3d、5d和7d組。以右側(cè)大腦中動(dòng)脈線栓法制備腦缺血再灌注損傷模型,針刺組為造模成功后在規(guī)定時(shí)間內(nèi)針刺百會(huì)和左足三里穴；藥物組為造模成功后腹腔注射依達(dá)拉奉。再灌注7d后,各組大鼠麻醉后斷頭取腦,TTC染色后以Image J計(jì)算其腦梗死體積; Tunel法檢測(cè)缺血區(qū)腦組織細(xì)胞凋亡情況。應(yīng)用免疫熒光法觀察基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、水通道蛋白4(AQP4)分別與星形膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞共表達(dá)情況；各組大鼠根據(jù)再灌注時(shí)間以改良的神經(jīng)功能評(píng)分評(píng)估大鼠神經(jīng)功能缺損情況；免疫組織化學(xué)染色和Western blot法檢測(cè)腦缺血大鼠MMP-2、AQP4.閉鎖小環(huán)蛋白(ZO-1)、閉合蛋白(Occludin)、雙股密封蛋白(Claudin-5)的表達(dá)；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)腦缺血大鼠MMP-2、AQP4、ZO-1、Occludin、Claudin-5mRNA及腦組織和外周血清中miRNA-29、miRNA-320的表達(dá)； 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.TTC染色顯示：假手術(shù)組大鼠雙側(cè)腦組織呈鮮紅色,未見(jiàn)缺血性改變；腦缺血再灌注損傷大鼠右側(cè)腦組織大腦中動(dòng)脈供血區(qū)域,可見(jiàn)到白色的梗死灶,與鮮紅色的正常腦組織形成對(duì)比。電針組和藥物組大鼠腦梗死體積低于模型組(P0.05),電針組大鼠腦梗死體積與藥物組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 2. TUNEL檢測(cè)結(jié)果顯示：棕黃色染色主要表達(dá)于胞核；假手術(shù)組凋亡細(xì)胞百分比顯著低于其他各組(P0.05)；電針組和藥物組細(xì)胞凋亡低于模型組(P0.05)；電針組和藥物組的細(xì)胞凋亡率無(wú)顯著性差異(P0.05)。 3.神經(jīng)功能缺損情況：mNSS評(píng)分顯示,假手術(shù)組大鼠腦組織無(wú)缺血,無(wú)肢體功能障礙,評(píng)分為0分；在同期各個(gè)時(shí)間點(diǎn),電針組和藥物組的評(píng)分均顯著低于模型組(P0.05)；在同期各個(gè)時(shí)間點(diǎn),電針組和藥物組神經(jīng)功能情況無(wú)顯著性差異(P0.05)。 4.血腦屏障相關(guān)指標(biāo)：(1)免疫熒光雙染顯示,腦缺血再灌注損傷后,MMP-2和AQP4主要表達(dá)在星形膠質(zhì)細(xì)胞足部并沿血管內(nèi)皮分布；(2)MMP-2在假手術(shù)組呈低表達(dá)；模型組、電針組和藥物組的峰值均在5d,與模型組相比,電針組及藥物組的MMP-2的蛋白及mRNA的表達(dá)均明顯降低(P0.05),在1、5d時(shí)間點(diǎn),電針組MMP-2的蛋白及mRNA水平顯著高于藥物組(P0.05)；(3)同期各個(gè)時(shí)間點(diǎn),電針組和藥物組ZO-1的蛋白及mRNA水平高于模型組(P0.05),在5、7d時(shí)間點(diǎn)ZO-1的蛋白及mRNA的表達(dá)在電針組和藥物組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；(4)與模型組相比,電針組和藥物組Claudin-5蛋白的表達(dá)顯著升高(P0.05)；(5)在1、3、5d時(shí)間點(diǎn),電針組和藥物組Occludin的蛋白及mRNA表達(dá)高于模型組(P0.05),同期各個(gè)時(shí)間點(diǎn), Occludin mRNA表達(dá)在電針組和藥物組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；(6)AQP4在模型組、電針組和藥物組的表達(dá)均成單峰,峰值為3d,與模型組相比,電針組AQP4蛋白及mRNA的表達(dá)在5、7d時(shí)間點(diǎn)顯著降低(P0.05),電針組AQP4mRNA的表達(dá)在7d時(shí)間點(diǎn)低于藥物組(P0.05)；(7)同期各個(gè)時(shí)間點(diǎn),電針組和藥物組腦組織及外周血清中miRNA-29c的表達(dá)低于模型組(P0.05),電針組與藥物組都能下調(diào)miRNA-29c表達(dá),電針組miRNA-29c在同一時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)高于藥物組(P0.05)。(8)同期各個(gè)時(shí)間點(diǎn),電針組和藥物組腦組織及外周血清中miRNA-320的表達(dá)高于模型組(P0.05),電針組與藥物組都能上調(diào)miRNA-320的表達(dá),電針組miRNA-320在同一時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)低于藥物組(P0.05)。 結(jié)論 1.大鼠腦缺血再灌注后腦組織中導(dǎo)致血腦屏障損傷的因子MMP-2、AQP4及miRNA-29c的表達(dá)增加,維系血腦屏障正常物質(zhì)代謝的因子ZO-1、Occludin、 Claudin-5及miRNA-320表達(dá)降低。 2.大鼠腦缺血再灌注后外周血清中miRNA-29c的表達(dá)增加,miRNA-320表達(dá)降低,與腦組織中表達(dá)趨勢(shì)一致。 3.針刺干預(yù)大鼠百會(huì)、足三里穴能下調(diào)MMP-2、AQP4及miRNA-29c的表達(dá)；上調(diào)ZO-1、Occludin、Claudin-5及miRNA-320表達(dá)。 4.針刺百會(huì)、足三里穴可明顯改善腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能缺損,減少腦梗死體積和細(xì)胞凋亡。 創(chuàng)新點(diǎn) 以線栓法成功復(fù)制了經(jīng)典的腦缺血再灌注損傷大鼠模型,根據(jù)再灌注后時(shí)間分為1d、3d、5d和7d時(shí)間點(diǎn),觀察針刺百會(huì)、足三里穴對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織MMP-2、AQP4、ZO-1、Occludin、Claudin-5的表達(dá)以及腦組織及外周血清中miRNA-29、miRNA-320的表達(dá)情況,探討了針刺對(duì)腦缺血再灌注損傷后血腦屏障破壞的保護(hù)作用機(jī)制；研究證明針刺百會(huì)、足三里穴對(duì)腦缺血再灌注大鼠血腦屏障損傷有保護(hù)作用。 經(jīng)文獻(xiàn)檢索,尚未發(fā)現(xiàn)針刺百會(huì)和足三里穴同時(shí)對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織及外周血清中miRNA-29、miRNA-320的干預(yù)研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R245

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2393323