【摘要】：研究目的 腦缺血再灌注后血腦屏障通透性增加導(dǎo)致腦水腫,引起腦組織的繼發(fā)性損傷。本論文探索了線栓法制作大鼠大腦中動脈閉塞腦缺血再灌注模型,并探討了針刺百會、足三里穴對腦缺血再灌注損傷后血腦屏障破壞的保護(hù)作用機(jī)制,為針刺治療缺血性腦血管病的研究提供進(jìn)一步的科學(xué)依據(jù)。 實驗方法 隨機(jī)數(shù)字表法將健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、電針組和藥物組。其中后三組根據(jù)再灌注時間分為1d、3d、5d和7d組。以右側(cè)大腦中動脈線栓法制備腦缺血再灌注損傷模型,針刺組為造模成功后在規(guī)定時間內(nèi)針刺百會和左足三里穴；藥物組為造模成功后腹腔注射依達(dá)拉奉。再灌注7d后,各組大鼠麻醉后斷頭取腦,TTC染色后以Image J計算其腦梗死體積; Tunel法檢測缺血區(qū)腦組織細(xì)胞凋亡情況。應(yīng)用免疫熒光法觀察基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、水通道蛋白4(AQP4)分別與星形膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞共表達(dá)情況；各組大鼠根據(jù)再灌注時間以改良的神經(jīng)功能評分評估大鼠神經(jīng)功能缺損情況；免疫組織化學(xué)染色和Western blot法檢測腦缺血大鼠MMP-2、AQP4.閉鎖小環(huán)蛋白(ZO-1)、閉合蛋白(Occludin)、雙股密封蛋白(Claudin-5)的表達(dá)；采用實時熒光定量PCR法檢測腦缺血大鼠MMP-2、AQP4、ZO-1、Occludin、Claudin-5mRNA及腦組織和外周血清中miRNA-29、miRNA-320的表達(dá)； 實驗結(jié)果 1.TTC染色顯示：假手術(shù)組大鼠雙側(cè)腦組織呈鮮紅色,未見缺血性改變；腦缺血再灌注損傷大鼠右側(cè)腦組織大腦中動脈供血區(qū)域,可見到白色的梗死灶,與鮮紅色的正常腦組織形成對比。電針組和藥物組大鼠腦梗死體積低于模型組(P0.05),電針組大鼠腦梗死體積與藥物組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。 2. TUNEL檢測結(jié)果顯示：棕黃色染色主要表達(dá)于胞核；假手術(shù)組凋亡細(xì)胞百分比顯著低于其他各組(P0.05)；電針組和藥物組細(xì)胞凋亡低于模型組(P0.05)；電針組和藥物組的細(xì)胞凋亡率無顯著性差異(P0.05)。 3.神經(jīng)功能缺損情況：mNSS評分顯示,假手術(shù)組大鼠腦組織無缺血,無肢體功能障礙,評分為0分；在同期各個時間點,電針組和藥物組的評分均顯著低于模型組(P0.05)；在同期各個時間點,電針組和藥物組神經(jīng)功能情況無顯著性差異(P0.05)。 4.血腦屏障相關(guān)指標(biāo)：(1)免疫熒光雙染顯示,腦缺血再灌注損傷后,MMP-2和AQP4主要表達(dá)在星形膠質(zhì)細(xì)胞足部并沿血管內(nèi)皮分布；(2)MMP-2在假手術(shù)組呈低表達(dá)；模型組、電針組和藥物組的峰值均在5d,與模型組相比,電針組及藥物組的MMP-2的蛋白及mRNA的表達(dá)均明顯降低(P0.05),在1、5d時間點,電針組MMP-2的蛋白及mRNA水平顯著高于藥物組(P0.05)；(3)同期各個時間點,電針組和藥物組ZO-1的蛋白及mRNA水平高于模型組(P0.05),在5、7d時間點ZO-1的蛋白及mRNA的表達(dá)在電針組和藥物組之間無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；(4)與模型組相比,電針組和藥物組Claudin-5蛋白的表達(dá)顯著升高(P0.05)；(5)在1、3、5d時間點,電針組和藥物組Occludin的蛋白及mRNA表達(dá)高于模型組(P0.05),同期各個時間點, Occludin mRNA表達(dá)在電針組和藥物組之間無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；(6)AQP4在模型組、電針組和藥物組的表達(dá)均成單峰,峰值為3d,與模型組相比,電針組AQP4蛋白及mRNA的表達(dá)在5、7d時間點顯著降低(P0.05),電針組AQP4mRNA的表達(dá)在7d時間點低于藥物組(P0.05)；(7)同期各個時間點,電針組和藥物組腦組織及外周血清中miRNA-29c的表達(dá)低于模型組(P0.05),電針組與藥物組都能下調(diào)miRNA-29c表達(dá),電針組miRNA-29c在同一時間點的表達(dá)高于藥物組(P0.05)。(8)同期各個時間點,電針組和藥物組腦組織及外周血清中miRNA-320的表達(dá)高于模型組(P0.05),電針組與藥物組都能上調(diào)miRNA-320的表達(dá),電針組miRNA-320在同一時間點的表達(dá)低于藥物組(P0.05)。 結(jié)論 1.大鼠腦缺血再灌注后腦組織中導(dǎo)致血腦屏障損傷的因子MMP-2、AQP4及miRNA-29c的表達(dá)增加,維系血腦屏障正常物質(zhì)代謝的因子ZO-1、Occludin、 Claudin-5及miRNA-320表達(dá)降低。 2.大鼠腦缺血再灌注后外周血清中miRNA-29c的表達(dá)增加,miRNA-320表達(dá)降低,與腦組織中表達(dá)趨勢一致。 3.針刺干預(yù)大鼠百會、足三里穴能下調(diào)MMP-2、AQP4及miRNA-29c的表達(dá)；上調(diào)ZO-1、Occludin、Claudin-5及miRNA-320表達(dá)。 4.針刺百會、足三里穴可明顯改善腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能缺損,減少腦梗死體積和細(xì)胞凋亡。 創(chuàng)新點 以線栓法成功復(fù)制了經(jīng)典的腦缺血再灌注損傷大鼠模型,根據(jù)再灌注后時間分為1d、3d、5d和7d時間點,觀察針刺百會、足三里穴對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織MMP-2、AQP4、ZO-1、Occludin、Claudin-5的表達(dá)以及腦組織及外周血清中miRNA-29、miRNA-320的表達(dá)情況,探討了針刺對腦缺血再灌注損傷后血腦屏障破壞的保護(hù)作用機(jī)制；研究證明針刺百會、足三里穴對腦缺血再灌注大鼠血腦屏障損傷有保護(hù)作用。 經(jīng)文獻(xiàn)檢索,尚未發(fā)現(xiàn)針刺百會和足三里穴同時對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織及外周血清中miRNA-29、miRNA-320的干預(yù)研究。
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【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R245

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2393323