【摘要】：研究背景肝臟是我們?nèi)梭w最大的消化器官,也是我們?nèi)梭w維持正常生命的必須部分。正常生理情況下,肝臟具有解毒、合成蛋白質(zhì)、貯存糖原、產(chǎn)生激素,降解紅細胞、生成機體消化食物所需的物質(zhì)(如膽汁)等作用。但肝臟同時也是各種疾病常常侵襲的器官,諸如代謝、中毒、微生物、循環(huán)障礙、病毒感染等均可造成肝臟的損傷。肝纖維化是多種慢性疾病如病毒性乙型肝炎、甲型肝炎、非酒精性肝炎、自發(fā)免疫性肝炎等通過一系列炎癥反應(yīng)導致肝臟組織內(nèi)出現(xiàn)過多的細胞外基質(zhì)(主要是膠原)沉積所致的一種病理改變。早期的肝纖維化可沿匯管區(qū)周圍或中心靜脈周圍分布,隨著纖維化的不斷進展,膠原逐漸將肝臟分割成大小不一的結(jié)節(jié),最終形成肝硬化、肝癌。目前肝纖維化、肝硬化、肝癌嚴重威脅著人類的健康,每年有27000人死于肝硬化。據(jù)估計肝硬化十年死亡率為34-66%。所幸研究表明,肝癌、肝硬化早期的肝纖維化在一定情況下是可以逆轉(zhuǎn)的,但是肝硬化肝癌不容易逆轉(zhuǎn),因此找出肝纖維化的發(fā)病機制及成功逆轉(zhuǎn)肝纖維化,可以挽救肝硬化肝癌病人。肝纖維化是許多慢性肝病共有的病理表現(xiàn)。目前認為,肝纖維化的形成是由于多種肝細胞損傷因子導致肝細胞損傷、壞死,繼而引起肝組織炎癥反應(yīng),激活kupper cell(KC),即肝巨噬細胞,釋放多種細胞因子及炎癥介質(zhì),這些細胞因子及炎癥介質(zhì)共同作用于靜息狀態(tài)下的肝星狀細胞(Hepatic Stellate Cell, HSC),使之激活、轉(zhuǎn)化為成肌纖維細胞,通過旁分泌及自分泌的機制,使肌纖維母細胞增殖,形成大量的膠原和蛋白多糖等構(gòu)成的細胞外基質(zhì),引起肝組織表型和功能上的改變。NF-κB,是一種多功能轉(zhuǎn)錄因子,廣泛存在于人體的組織細胞內(nèi),許多炎性介質(zhì)的表達都有賴于NF-K B,而不適當?shù)拇碳せ騈F-κB過度活化則與機體的多種炎癥反應(yīng)關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn),在哮喘的炎癥反應(yīng)中,多種炎性蛋白(IL-1 β,TNF-α、IL-10,TGF-β等)在轉(zhuǎn)錄水平上受到NF-κB的調(diào)控,NF-κB活化后它們的基因表達和蛋白分泌均增高。肝纖維化是肝臟對多種損傷因子激活炎癥反應(yīng)后修復不良所致,而如上述研究報道,NF-κB在炎癥時能對多種細胞因子在轉(zhuǎn)錄上平上調(diào)控,因此,NF-κB與肝纖維關(guān)系密切。據(jù)報道用乙醇損傷動物的肝臟,可發(fā)現(xiàn)NF-κB的活性增強,其機制有可能是KC上的NF-κB被激活,活化后的NF-κB能夠上調(diào)KC炎性介質(zhì)(如TGF-β、TNF-、等)表達的作用,使KC細胞產(chǎn)生的炎性介質(zhì)遠遠多于抗炎介質(zhì),而產(chǎn)生的炎性介質(zhì)一方面作用于未活化的KC細胞中的NF-κB,產(chǎn)生更多的炎性介質(zhì),形成“炎性瀑布”,造成肝損傷,另一方面可迅速使HSC活化、增殖,最終形成肝纖維化。Act1是一個能夠活化NF-κB的基因,是通過NF-κB依賴的篩選方法克隆得到的,也稱之為TRAF3作用蛋白2 (TRAF3IP2)或CIKS (connection to IκB kinase and stress-activated protein kinases)。它表達于人體的骨髓、肺、肝臟組織等。Actl蛋白共有574個氨基酸,其相對分子量為60000,不含已知的酶結(jié)構(gòu)域,N端是一個螺旋-環(huán)-螺旋區(qū)(HLH,135-190),C端有一個卷曲螺旋-卷曲螺旋(C-C,470-500)。它還含有兩個TRAF (tumor necrosis factor receptor associated factor)連接區(qū)域(EEESE,38-42基團；EEERPA,333-337基團)和一個SEFIR(similar expression to fibroblast growth factor genes and IL-17Rs)·(394-574基團)區(qū)域。Actl尚存在一個缺乏外顯子2編碼的前9個氨基酸的剪接體,研究證明Actl的剪接體具有激活NF-κB和急性期反應(yīng)蛋白(AP)-1的功能,在炎癥和免疫損傷中發(fā)揮著重要作用。Actl對NF-κB的活化主要是通過兩個TRAF與TAK1, NIK或者類NIK蛋白以及IKK信號通路的信號分子相互來發(fā)揮作用。在肝纖維化形成的過程中,TGFβ1-Smad3是促進肝纖維化的主要信號通路。巨噬細胞釋中NF-κB可以上調(diào)TGFβ1的表達,激活HSC, HSC合成膠原,纖維蛋白及蛋白多糖,并抑制基質(zhì)金屬蛋白酶合成,促進HSC分泌組織金屬蛋白酶抑制劑和PAI-1等減少細胞外基質(zhì)降解。其傳導過程為：TGFβ1活化后與TGFβⅡ型受體結(jié)合,形成異二聚體,隨即被Ⅰ型受體識別組合成受體異聚體復合物,異聚體復合物中的工型受體被Ⅱ型受體磷酸化,磷酸化的工型受體將信號放大并進一步磷酸化胞漿中的Smad3,磷酸化的Smad3與Smad4分子形成Smad復合物并進入細胞核內(nèi)與靶基因結(jié)合調(diào)控其轉(zhuǎn)錄和表達。綜上所述,肝巨噬細胞參與了肝纖維化的形成,而肝巨噬細胞中NF-κB上調(diào)TGF-β1促進肝纖維化的發(fā)生。且最近研究表明,選擇性去除肝中的巨噬細胞可減輕肝纖維化的發(fā)展。但是并沒有文獻表明選擇性的沉默肝巨噬細胞上Act1基因?qū)Ω卫w維化形成的影響。考慮到Act1基因是NF-κB的激活因子,且肝巨噬細胞的NF-κB參與肝纖維化的發(fā)展,因此本課題假設(shè)肝巨噬細胞Act1基因沉默可能通過降低NF-κB的磷酸化水平從而下調(diào)TGF-β1/smad3的表達,最終減輕肝纖維化的形成。目的本研究旨在通過檢測肝巨噬細胞Act1基因及NF-κB、TGFβ1、Smad3在肝纖維化中的表達變化和相互聯(lián)系,初步探討肝巨噬細胞Act1基因在肝纖維化中的作用,為肝纖維化的診斷和臨床治療提供新思路及方向。方法1.鑒定anti-Act1(即肝巨噬細胞Act1基因沉默)轉(zhuǎn)基因小鼠剪取小鼠尾部組織1cm,提取DNA,采用瓊脂糖凝膠電泳方法,按照目的條帶的大小鑒定出anti-Act1轉(zhuǎn)基因小鼠。采用免疫組化方法及免疫熒光的方法,檢測肝巨噬細胞上Act1基因的表達及沉默。2.CCl4誘導C57和anti-Act1轉(zhuǎn)基因小鼠肝纖維化模型的建立將6-8周齡anti-Actl轉(zhuǎn)基因小鼠及其背景小鼠C57,均按2ml/kg體重腹腔注射橄欖油溶劑和CCl4溶液(4：1),每周注射2次,注射6周,比較各組肝臟的纖維化程度；3.總膽管結(jié)扎anti-Actl和C57轉(zhuǎn)基因小鼠誘導肝纖維化模型的建立將6-8周齡C57和anti-Actl轉(zhuǎn)基因小鼠隨機分為膽總管結(jié)扎組(bile duct ligation,BDL)和假手術(shù)組(sham).結(jié)扎組小鼠腹部皮膚常規(guī)消毒,沿腹正中線剪開,暴露膽總管,將膽總管遠、近端結(jié)扎3次,縫合腹部。假手術(shù)組僅開腹并游離膽總管而不結(jié)扎,隨后縫合腹部。兩周后,小鼠麻醉并收集血液和肝臟標本。4.C57/olive,C57/CCl4,anti-Actl/ol1ive,anti-Actl/CCl4,C57/sham, C57/BDL,anti-Actl/sham,anti-Actl/BDL組小鼠肝纖維化程度通過HE、天狼猩紅染色,免疫組化染色方法分別觀察各組肝組織結(jié)構(gòu)、肝臟膠原纖維含量,比較肝纖維化的嚴重程度。5.C57/olive,C57/CCl4,anti-Actl/olive,anti-Actl/CCl4,C57/sham, C57/BDL,anti-Actl/sham,anti-Actl/BDL組肝損傷的程度。采用ALT,AST,HYP檢測試劑盒,運用酶標儀讀取數(shù)值,比較各組肝損傷的程度。6.C57/olive,C57/CCl4,anti-Actl/olive,anti-Actl/CCl4,NF-κB(P65)及TGFβ1、Smad3相關(guān)蛋白表達檢測采用Western blot檢測各組肝組織中P65、TGFβ1、p-Smad3的表達。7.肝纖維化程度判斷標準按照Ishak Stage標準,小鼠肝纖維化分為6期：“0”無纖維增生；“1”一些匯管區(qū)生成纖維,有或者無短的纖維間隔；“2”大多數(shù)匯管區(qū)生成纖維,有或者無短纖維間隔；“3”大多數(shù)匯管區(qū)生成纖維,門管區(qū)之間偶爾有纖維連接；“4”匯管區(qū)生成纖維,門管區(qū)之間形成明顯的纖維連接；“5”門管區(qū)之間形成大量明顯的纖維連接,可見纖維結(jié)節(jié)；“6”大量的纖維結(jié)節(jié)形成。8.統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)均使用Graphpad4.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。多組間比較采用ONE WAY ANOVA分析,兩組間比較采用t檢驗,結(jié)果用均數(shù)±標準差表示,P0.05具有統(tǒng)計學差異。結(jié)果1.成功鑒定并檢測肝巨噬細胞Act1的表達及沉默按照上海中科院構(gòu)建的anti-Actl轉(zhuǎn)基因小鼠確定的條帶位置為250bp,我們的瓊脂糖凝膠電泳上的條帶位置與之一致。免疫組化及免疫熒光提示,Act1基因表達于正常的肝組織巨噬細胞上,而沉默Act1基因后,肝巨噬細胞上不表達Act1。2.成功構(gòu)建CCl4/BDL誘導的肝纖維化模型HE染色及天狼猩紅染色結(jié)果顯示C57/CCl4, C57/BDL, anti-Actl/CCl4, anti-Act1/BDL小鼠的肝組織中見膠原纖維沿匯管區(qū)分布,C57/ol ive和anti-Act1/olive,C57/sham和anti-Actl/sham小鼠肝臟未見膠原纖維沉積。3. 肝巨噬細胞Act1基因促進肝纖維化形成HE,天狼猩紅染色及免疫組化檢測發(fā)現(xiàn),C57/CCl4,C57/BDL組肝中的膠原纖維含量明顯高于anti-Actl/CCl4, anti-Actl/BDL組,且P0.05,差異具有統(tǒng)計學意義。而C57/olive和anti-Actl/olive與C57/sham和anti-Actl/sham＼鼠沒有統(tǒng)計學差異。4. NF-κB、TGF-β1/Smad3參與了肝巨噬細胞Act1基因介導的肝纖維化形成Western免疫印跡發(fā)現(xiàn),C57/CC14中的p65,TGF-β1及Smad3表達高anti-Act1/CCl4,, C57/olive和anti-Act1/olive小鼠組TGF-β1及Smad3無變化。P0.05,差異具有統(tǒng)計學意義。結(jié)論1.肝巨噬細胞Actl基因促進肝纖維化的形成及進展。2.靶向沉默肝巨噬細胞Actl基因通過降低NF-κB的磷酸化水平從而下調(diào)TGF-β1/Smad3的表達,最終減輕肝纖維化的形成。創(chuàng)新點靶向沉默肝巨噬細胞Actl基因通過降低NF-κB的磷酸化水平從而下調(diào)TGF-β1/Smad3的表達,最終減輕肝纖維化的形成,為肝纖維化發(fā)生機制及治療靶點提供新理論;
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【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R575.2

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