【摘要】：急性脊髓損傷是嚴重致殘性疾病,可導致患者的運動功能障礙,嚴重的后遺癥和并發(fā)癥給患者個人和家庭以及社會帶來巨大的經濟負擔。急性脊髓損傷包括原發(fā)性脊髓損傷和繼發(fā)性脊髓損傷。繼發(fā)性脊髓損傷導致原發(fā)性脊髓損傷對脊髓的傷害進一步加劇,但這個過程又是具有可逆性和可調控性的,因此對繼發(fā)性脊髓損傷的轉歸對脊髓神經的修復和再生具有非常重要的價值和意義。目前,對急性脊髓損傷治療的關鍵點集中在繼發(fā)性脊髓損傷病理反應和機制的研究。自噬(autophagy)是由Ashford和Porter在1962年發(fā)現(xiàn)細胞內有“自己吃自己”的現(xiàn)象后提出的,是胞內形成雙層膜包裹部分胞質和細胞內需降解的細胞器、蛋白質等成分形成自噬體(autophagosome),并與溶酶體融合形成自噬溶酶體,降解其所包裹的內容物,以實現(xiàn)細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新。在脊髓損傷中,神經元作為終末分化細胞,自噬的發(fā)生顯得尤為重要。近年來,越來越多的研究集中到脊髓損傷后自噬的發(fā)生以及作用機制。 第一章急性脊髓損傷模型的建立 [摘要]目的制作脊髓損傷模型,為脊髓損傷后神經再生和修復提供良好的觀察模型。方法采用SPF級Sprague-Dawley大鼠(SD大鼠),成年雄性,體重在200-250g之間,分為正常的脊髓,損傷后4h(小時)、1d(天)、3d、7d、21d、60d和90d幾個小組,每個小組8只動物,實驗動物給予10%戊巴比妥鈉300mg/kg的腹腔注射麻醉。制作右側半橫切的急性脊髓損傷模型。采用HE染色和甲苯胺藍染色進行脊髓損傷后病理學檢測,利用BBB評分法評價損傷后動物的運動功能。結果在急性脊髓損傷動物模型制作過程和制作后會出現(xiàn)部分動物死亡的現(xiàn)象,死亡的動物及時給與補充。HE病理學檢測顯示正常脊髓切片,神經元和膠質細胞均勻分布,細胞胞體飽滿,細胞核和細胞質界限明顯。脊髓損傷的組織切片內出現(xiàn)大量的空腔,空腔內存在壞死組織碎片,細胞組織內出現(xiàn)液化壞死。白質內出現(xiàn)組織廣泛水腫的現(xiàn)象,呈海綿狀。脊髓損傷3d后,大鼠右后側肢體癱瘓,無運動,BBB評分平均值為0.7分；隨著損傷時間的延長,大鼠脊髓的運動有部分功能的恢復,在損傷后60d和90d,大鼠后肢的三個關節(jié)存在輕微的活動,有些甚至出現(xiàn)兩到三個關節(jié)的廣泛運動,經BBB評分平均值為6.8分。結論右側半橫切的急性脊髓損傷模型不但能造成模型動物的感覺和運動的半邊癱瘓,同時為脊髓損傷后神經再生和修復提供了良好的觀察模型。 [摘要]目的探討脊髓損傷后自噬的發(fā)生和自噬流的動態(tài)過程,并確定自噬在脊髓損傷后神經元和膠質細胞的定位。方法制作半橫切的急性脊髓損傷模型,損傷后4h、1d、3d、7d、21d,利用Western和免疫組織化學檢測方法檢測自噬相關蛋白Beclinl、LC3的表達,利用RT-PCR檢測Beclinl mRNA的表達,透射電鏡檢查損傷后自噬小體的形成。利用West(;rn檢測方法檢測自噬底物蛋白p62的表達,并利用免疫組織化學檢測方法檢測自噬和神經元、膠質細胞的共定位。結果經過Western條帶的密度掃描分析和免疫組織化學檢測,脊髓損傷后4h LC3和Beclinl蛋白的表達量較正常對照的脊髓組織有所提高,隨著時間的延長,兩者的表達量也隨著升高,在脊髓損傷的3d達到表達量的高峰期,在7d和21d表達量逐漸降低,但較正常對照組仍有所升高。經過透射電鏡觀察,我們發(fā)現(xiàn)正常對照的脊髓組織結構顯示正常,髓鞘呈同心圓排列,層間排列結合緊密。脊髓損傷后4h,我們發(fā)現(xiàn)神經出現(xiàn)脫髓鞘現(xiàn)象,層間的排列發(fā)生紊亂,出現(xiàn)大量空泡。經Western檢測顯示,脊髓損傷4h后自噬底物p62的表達量較正常對照組織有所下降,并隨著損傷進程的進行,表達量逐漸降低,1d、3d、7d和21d均較正常對照組織有大量的降低,較正常對照的脊髓組織表達量的差異有統(tǒng)計學意義,P0.05。經過共定位發(fā)現(xiàn),脊髓損傷后自噬發(fā)生于神經元和膠質細胞中。結論脊髓損傷后神經組織發(fā)生了自噬,并且隨著損傷病理的進程,自噬的活性不斷增強,在3d達到了高峰期。自噬的過程不僅發(fā)生于脊髓組織的神經元,同時也發(fā)生于膠質細胞中,提示自噬的活動對脊髓損傷的病理活動存在一定的影響。 第三章脊髓損傷后自噬發(fā)生的作用 [摘要]目的探討急性脊髓損傷后,自噬活動的發(fā)生對脊髓功能恢復的作用。方法采用自噬抑制劑3-MA和自噬增強劑Rapamycin腹腔注射脊髓損傷后的大鼠,于損傷后4h,1d、3d、7d、21d通過Western和免疫組織化學檢測方法檢測自噬相關蛋白Beclinl、LC3的表達,并利用BBB評分法檢測自噬抑制和增強后對脊髓神經功能的恢復作用。結果經過Western和免疫組織化學檢測,我們發(fā)現(xiàn)單純的脊髓損傷組各個時間點的Beclinl和LC3B的表達較正常對照組均有所提高。3-MA組中,B eclinl和LC3B的表達在脊髓損傷4h、1d、3d、7d和21d后較單純的脊髓損傷組有所下降,且差異具有統(tǒng)計學意義,Rapamycin組中,Beclinl和LC3B的表達在脊髓損傷4h, Id、3d、7d和21d后較單純的脊髓損傷組有所升高,且差異具有統(tǒng)計學意義,P0.05。經過免疫組織化學的LC3和1AP-2、 GFAP的共定位,3-MA組中,神經元和膠質細胞中的自噬的表達在4h、1d、3d、7d和21d逐漸降低,較單純的脊髓損傷組有所下降,且差異具有統(tǒng)計學意義,P0.05。Rapamycin組中,神經元中和膠質細胞的自噬的表達在4h、1d、3d、7d和21d逐漸升高,較單純的脊髓損傷組有所提高,且差異具有統(tǒng)計學意義,P0.05。經BBB評分,抑制自噬能阻礙脊髓損傷大鼠的運動功能的恢復,增強自噬能促進脊髓損傷大鼠的運動功能的恢復。結論脊髓損傷后,3-MA能夠抑制自噬的發(fā)生,Rapamycin能夠促進自噬的發(fā)生。3-MA能夠抑制噬神經元和膠質細胞的發(fā)生,Rapamycin能夠促進神經元和膠質細胞自噬的發(fā)生。抑制自噬能阻礙脊髓損傷大鼠的運動功能的恢復,增強自噬能促進脊髓損傷大鼠的運動功能的恢復。 第四章脊髓損傷自噬對神經功能修復的作用機制 [摘要]目的探討急性脊髓損傷后,自噬過程對脊髓神經功能修復的作用機制。方法采用自噬抑制劑3-MA和自噬增強劑Rapamycin腹腔注射脊髓損傷后的大鼠,于損傷后4h、1d、3d、7d、21d通過免疫組織化學技術檢測凋亡指示蛋白activated caspase-3表達,通過Western檢測凋亡相關蛋白Bcl-2、BAX的表達,并利用BBB評分法檢測自噬抑制和增強后對脊髓神經功能的恢復作用。結果經凋亡表達的marker蛋白activated caspase-3與脊髓組織神經元的marker蛋白MAP2及膠質細胞的marker蛋白GFAP的免疫組織化學共定位發(fā)現(xiàn),3-MA組中,activated caspase-3在損傷脊髓組織中的表達量在脊髓損傷4h、1d、3d、7d和21d后較單純的脊髓損傷組有所上升,且差異具有統(tǒng)計學意義,P0.05。 Rapamycin組中,activated caspase-3的表達在脊髓損傷4h、1d、3d,7d和21d后在損傷脊髓組織中的表達量較單純的脊髓損傷組有所下降,且差異具有統(tǒng)計學意義,P0.05。經過Western檢測,我們發(fā)現(xiàn)單純的脊髓損傷組各個時間點的Bcl-2的表達較正常對照組均有所提高。3-MA組中,Bcl-2的表達在脊髓損傷4h、1d、3d、7d和21d后較單純的脊髓損傷組有所下降,且差異具有統(tǒng)計學意義, P0.05。Rapamycin組中,Bcl-2的表達在脊髓損傷4h、1d、3d、7d和21d后較單純的脊髓損傷組有所升高,且差異具有統(tǒng)計學意義,P0.05。經過Western檢測,我們發(fā)現(xiàn)單純的脊髓損傷組各個時間點的BAX的表達較正常對照組均有所下降。3-MA組中,BAX的表達在脊髓損傷4h、1d、3d、7d和21d后較單純的脊髓損傷組有所上升,且差異具有統(tǒng)計學意義,P0.05。Rapamycin組中,BAX的表達在脊髓損傷4h、1d、3d、7d和21d后較單純的脊髓損傷組有所下降,且差異具有統(tǒng)計學意義,P0.05。結論脊髓損傷后,自噬的抑制能夠誘發(fā)神經元和膠質細胞的凋亡,自噬的增強能夠抑制神經元和膠質細胞的凋亡；自噬的抑制能夠抑制Bcl-2的表達,促進BAX的表達,自噬的增強能夠促進Bcl-2的表達,抑制BAX的表達。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南開大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R651.2

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本文編號：2352751