【摘要】：地黃作為傳統四大懷藥之一,是常用的滋補類中藥,在中藥處方中使用廣泛。其主要活性成分梓醇具有防治癡呆、抗腦缺血、利尿、降血糖等多種生物活性,有較大的藥用價值。但現有文獻提示梓醇不同給藥途徑出現劑量效應差異顯著,其原因尚未探明。本研究擬采用ALX致糖尿病模型,來驗證不同途徑給予梓醇出現降糖作用是否出現劑量上的巨大差異；在此基礎上研究(1)胃腸理化環(huán)境(酸堿度)對梓醇穩(wěn)定性的影響；(2)肝微粒體酶對梓醇代謝的影響；(3)考察梓醇不同給藥途徑的藥代動力學差異。以期探索梓醇不同給藥途徑出現治療作用劑量差異的可能機制,為梓醇的后期成藥研究,如給藥途徑和劑型選擇等提供前期研究基礎。 第一部分：梓醇不同方式給藥下對ALX致糖尿病大鼠的治療作用 考察不同給藥方式下,梓醇對糖尿病大鼠治療作用的差異。正常組大鼠為隨機選取8只大鼠,普通飼養(yǎng),不做任何處理。造模方法是大鼠在禁食不禁水的情況下喂養(yǎng)12小時后,采取兩步給藥法,腹腔注射新鮮配制的1%四氧嘧啶生理鹽水溶液制備糖尿病模型：第1天一次性腹腔注射1%四氧嘧啶120mg/kg,第2天一次性補注100mg/kg。后經過72h的自由飲食后,禁食12h于眼眶取血用血糖儀測定血糖值,挑選血糖值大于16.7mmol/L的大鼠作為糖尿病大鼠模型。均以500mg/kg二甲雙胍作為陽性對照藥物,藥物分為梓醇灌胃亞組(50、100、200mg/kg)和靜脈注射亞組(5、10、20mg/kg),從造模成功后開始給藥,正常組和模型組大鼠靜脈注射相應體積的生理鹽水,1次/d,連續(xù)注射兩周�？疾扈鞔紝ζ溲茄胶吞悄土康挠绊�。結果表明,不同的給藥方式對降糖降脂效應的劑量有明顯差異,灌胃給藥梓醇具有明顯降糖降脂作用的劑量為200mg/kg;而靜脈注射梓醇5、10、20mg/kg劑量均有明顯降糖降脂,改善糖耐量水平作用,呈明顯的量效依賴性。 第二部分：梓醇不同給藥劑量差異顯著原因探索 為了對梓醇不同方式給藥導致療效差異較大的原因進行探討,我們對梓醇在不同PH條件下的穩(wěn)定性,肝微粒體代謝,梓醇不同方式給藥的藥動學進行研究。 實驗一胃腸理化環(huán)境(酸堿度)對梓醇穩(wěn)定性的影響 考察梓醇在酸堿環(huán)境中的化學穩(wěn)定性,使梓醇在PH值分別為1、2、3、5、7.4、9、12的溶液,37℃條件下保留,并14h取樣測定梓醇濃度變化情況。SD大鼠,禁食36h,用3.5%水合氯醛麻醉,剪開腹部肌肉,暴露胃,于賁門處插管并結扎責門,于幽門處插管并結扎幽門,用去胃蛋白酶的人工胃液5m1洗滌大鼠胃2次后,于胃中注入5m1人工胃液保留2h,取樣測定梓醇濃度變化情況；SD大鼠,禁食36h,用3.5%水合氯醛麻醉,剪開腹部肌肉,暴露腸道,于屈氏韌帶下10cm,距回盲部上10cm插管并結扎。用人工腸液20m1洗滌大鼠腸道2次,于腸中注入10m1人工腸液保留2h,取樣測定梓醇濃度變化情況。結果表明梓醇在PH為1,2,3時,較不穩(wěn)定。隨著時間的變化,呈線性下降趨勢,酸度越高,下降越快。當PH5時,隨時間變化不大。PH為堿性時,梓醇濃度也無明顯變化。說明梓醇在酸性環(huán)境下易破壞,在堿性條件下相對穩(wěn)定。梓醇在灌胃人工胃液中的濃度變化顯示：隨著時間的變化,梓醇濃度下降明顯,呈現線性下降趨勢；梓醇在灌腸人工胃液中的濃度變化顯示：隨著時間的變化,梓醇濃度下降明顯,呈現線性下降趨勢,但下降速度不如在灌胃保留液中明顯。 實驗二梓醇在肝微粒體酶中的代謝情況 考察梓醇在肝微粒體酶中的代謝情況,了解肝微粒體酶對梓醇的穩(wěn)定性的影響。整個肝微粒體孵化體系約0.5m1,其中緩沖體系為0.1mol/L Tris-HCl緩沖溶液(PH=7.4),梓醇10mg/L,肝微粒體蛋白lg/L, MgCl210mmol/L, KC110mmol/L,系統37℃水浴5min,加入同樣預熱的反應啟動液NADPH lmmol/L開始,于水浴反應30min,取出放入冰浴終止反應。并對反應時間,蛋白濃度,梓醇濃度做了篩選,得到最優(yōu)反應條件；選出最優(yōu)條件后通過底物消除法對酶促動力參數Km、Vmax和CLint進行了測定；最后測定CYP450酶亞型專屬性抑制劑對梓醇代謝的抑制作用以及抑制作用大小,鑒別出參與梓醇的代謝的CYP450酶亞型。梓醇在0～60min孵育,其中0～30min內線性較好；梓醇在蛋白濃度為0.2～2.0g/L范圍內孵育,梓醇在蛋白濃度0.2～1g/L范圍內蛋白質量濃度增加,梓醇消除線性增加,所以梓醇在微粒體中孵育蛋白濃度確認為1.0g/L；不同濃度的梓醇(濃度2～100mg/L)在蛋白濃度為1.0g/L的微粒體中孵育30min,當底物濃度10mg/L時,梓醇的代謝速率開始減慢,當底物濃度50mg/L時,減慢比較明顯,所以梓醇在微粒體中的孵育的最佳濃度選取了10mg/L。通過底物消除法公式,繪圖計算后,得到梓醇在肝微粒體中的代謝Vmax為3.24mg/(L·min·mg), Km為0.44mg/L, CLint為7.3mL/(min·mg)。結果表明,CYP2C19的特異性抑制劑噻氯匹啶在較低濃度(1.25μ mol/L)即對肝微粒酶對梓醇的代謝其抑制作用,且40μmol/L抑制效果大于50%,為強效抑制劑；CYP3A4的特異性抑制劑酮康唑在0.1μ mol/L即可對梓醇代謝其顯著抑制作用且4μmol/L時抑制效果大于50%,為強效抑制劑。CYP2D6的特異性抑制劑奎尼丁在1μmol/L時也表現出對梓醇代謝的抑制作用,20μmol/L時抑制效果在20～50%之間,為中效抑制劑。而其他藥物對梓醇的代謝無顯著影響,即梓醇主要通過CYP2C19,CYP3A4,CYP2D6發(fā)生代謝作用。 實驗三考察梓醇不同給藥途徑(肌注,灌胃,靜注)的藥代動力學差異 研究梓醇在不同給藥途徑(肌注,灌胃,靜注)的藥代動力學參數差異。取SPF級SD大鼠18只,實驗前禁食12h,隨機分為3組,分別進行灌胃,后腿肌肉注射,尾靜脈注射給藥,給藥劑量50mg.kg-1,于給藥前(0min)和給藥后2、5、15、30、60、120、180、300、480、600min,眼眶動脈采血,血樣經處理后進行HPLC分析。將所得的血藥濃度-時間數據,用DAS3.5中統計矩方法求算藥代動力學參數。結果表明,梓醇在口服,肌注和靜注后,藥動學參數顯示,口服半衰期(t1/2z=1.39±0.22h)顯著長于肌注(t1/2z=0.84±0.41h)和靜注(t1/2z=0.68±0.24h),這可能是口服吸收時間較長所致。口服梓醇體內滯留時間MRT為3.23±0.37h,長于肌注MRT(1.62±0.20h)和靜注MRT(1.71±0.29h),和靜注比具有顯著性差異(P0.01)。肌肉注射吸收迅速,Tmax為0.25±0.1h顯著短于口服1.66±0.58h。一般認為,大鼠Vz/F小于5L指藥物主要分布于血漿,所以口服1.17±0.16L/kg,肌注Vz/F為0.40±0.20L/kg,靜注Vz/F為0.57±0.19L/kg,都代表藥物主要分布于血漿。肌注生物利用度為71.63%大于口服的49.38%。梓醇在胃腸道不穩(wěn)定,但是其灌胃生物利用度接近50%,這結果和梓醇灌胃和靜脈注射治療糖尿病療效相差近10倍有差異,原因可能和梓醇在體內產生的代謝產物有關。
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【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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本文編號：2346756