【摘要】：研究背景：骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis, OP)作為一種系統(tǒng)性骨病一直被眾多科研工作者和臨床醫(yī)務(wù)人員所關(guān)注,其主要表現(xiàn)為骨量減少,骨脆性增加以及骨折。隨著我國(guó)乃至世界范圍內(nèi)人口老齡化的到來(lái),包括絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥在內(nèi)的原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)成為一個(gè)亟待解決的醫(yī)療問(wèn)題和社會(huì)問(wèn)題。另外,一些其他因素如全身性疾病引發(fā)的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥也嚴(yán)重威脅著人類的健康。其中,糖尿病性骨質(zhì)疏松癥因骨質(zhì)破壞嚴(yán)重、骨折并發(fā)率高等特征,受到越來(lái)越多國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。近年來(lái),絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者糖尿病發(fā)病率正在逐年升高,絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者并發(fā)糖尿病后的骨質(zhì)改變及其相關(guān)機(jī)制的進(jìn)一步闡明將為如何提高老年婦女的生活質(zhì)量提供有意義的理論依據(jù)。目的：本研究擬通過(guò)建立單純絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、單純1型糖尿病性骨質(zhì)疏松癥及伴發(fā)1型糖尿病的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,系統(tǒng)評(píng)價(jià)1型糖尿病對(duì)去勢(shì)模擬的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠骨改建的影響并探討相關(guān)機(jī)制,以期為骨質(zhì)疏松癥的臨床干預(yù)和治療提供理論支撐。方法：第一部分：8周齡雌性Wistar大鼠40只,隨機(jī)分為對(duì)照組(BC組),去勢(shì)組(ED組),1型糖尿病組(DM組),去勢(shì)合并1型糖尿病組(ED+DM組),每組10只。ED和ED+DM組切除雙側(cè)卵巢,建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠模型。4周后對(duì)DM組和ED+DM組大鼠一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(1% STZ,pH4.5, 50mg/kg),分別建立1型糖尿病骨質(zhì)疏松癥和伴發(fā)1型糖尿病的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠模型。各組大鼠達(dá)21周齡時(shí),每組隨機(jī)選擇5只大鼠脫頸處死,分離雙側(cè)脛骨,經(jīng)4%多聚甲醛液外固定、PBS沖洗、組織修剪等一系列步驟后,將脛骨沿其長(zhǎng)軸方向排列并固定,置入Micro CT中進(jìn)行掃描。掃描參數(shù)：掃描電壓80kVp,電流500μA,分辨率10μm,曝光時(shí)間2500ms。選取距脛骨生長(zhǎng)板遠(yuǎn)端1.0mm,厚度1.0mm松質(zhì)骨為感興趣區(qū)域(ROD,應(yīng)用Micro CT自帶的Inveon Research Workplace 2.2軟件進(jìn)行三維重建。應(yīng)用軟件分析ROI區(qū)域的骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV,%),骨小梁厚度(Tb.Th,μm),骨小梁數(shù)量(Tb.N,1/mm),骨小梁分離度(Tb.Sp,μm),骨小梁模式因子(Tb.Pf,1/mm)及骨密度(BMD, mg/cm3)。第二部分：動(dòng)物模型及分組情況同第一部分,各組大鼠達(dá)21周齡時(shí),每組選擇5只大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉,4%多聚甲醛液進(jìn)行心臟內(nèi)灌注固定,分離大鼠雙側(cè)股骨和脛骨,經(jīng)過(guò)固定、脫鈣、脫水、透明、浸蠟、包埋等一系列步驟后,制備長(zhǎng)骨冠狀向5μm連續(xù)切片。對(duì)切片行HE染色評(píng)價(jià)組織學(xué)形態(tài),免疫組織化學(xué)染色和酶化學(xué)染色檢測(cè)成骨相關(guān)因子(ALP)和破骨相關(guān)因子(TRAP、CK)的表達(dá)情況。每個(gè)標(biāo)本選擇10張切片,每個(gè)切片選擇3個(gè)不同的視野應(yīng)用IPP軟件進(jìn)行破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)和免疫染色強(qiáng)度分析。第三部分：動(dòng)物模型及分組情況同第一部分,大鼠脫頸處死后,分離股骨,采用Trizol法提取股骨組織中的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。分別檢測(cè)Wnt/β-catenin (LRP5、β-catenin、Runx2)和NF-κB(RANKL、 OPG, RANKL/OPG、TRAF6、NF-κB)信號(hào)通路相關(guān)因子的]mRNA相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果：第一部分：①大鼠空腹血糖變化情況：STZ注射后,DM組、ED+DM組血糖與時(shí)間呈正相關(guān)(P0.01),其中ED+DM組略高于DM組,BC組和ED組未見(jiàn)明顯變化。②大鼠體重變化情況：ED組體重與時(shí)間呈正相關(guān)(P0.01),DM組、ED+DM組體重與時(shí)間呈負(fù)相關(guān)(P0.01),BC組未見(jiàn)明顯變化。③骨小梁結(jié)構(gòu)參數(shù)：同BC組相比,ED、DM、ED+DM組的BV/TV、Tb.Th、Tb.N及BMD均降低(P0.05),其中ED+DM組最低；ED組BV/TV、Tb.N低于DM組,Tb.Th、BMD高于DM組(P0.05)。與BC組比較,ED、ED+DM組的Tb.Sp均升高(P0.05),DM組未見(jiàn)明顯差異；ED、DM、ED+DM組Tb.Pf均升高(P0.05),ED+DM組最高,DM組與ED組之間未見(jiàn)明顯差異。第二部分：①ALP免疫組織化學(xué)染色：四組中ED組ALP表達(dá)最強(qiáng)(P0.05),在生長(zhǎng)板下方和骨小梁表面可見(jiàn)大量的ALP陽(yáng)性成骨細(xì)胞；ED+DM組最低(P0.05),僅在生長(zhǎng)板下方可見(jiàn)極少量的ALP陽(yáng)性細(xì)胞,骨小梁表面幾乎不可見(jiàn)；DM組ALP表達(dá)強(qiáng)度較ED+DM組略高,仍低于BC組和ED組(P0.05),在生長(zhǎng)板下方可見(jiàn)散在的ALP陽(yáng)性細(xì)胞,部分骨小梁表面可見(jiàn)少量ALP陽(yáng)性成骨細(xì)胞。② TRAP陽(yáng)性破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)及CK免疫組織化學(xué)染色：與BC組比較,ED組破骨細(xì)胞數(shù)量最多(P0.05),其破骨細(xì)胞不僅胞核多,體積大,而且CK表達(dá)強(qiáng)度較高(P0.05)；DM組、ED+DM組TRAP陽(yáng)性破骨細(xì)胞數(shù)量較少(P0.05),破骨細(xì)胞CK表達(dá)強(qiáng)度低(P0.05),細(xì)胞體積小,胞核數(shù)量少,DM組與ED+DM組的破骨細(xì)胞數(shù)量及CK表達(dá)強(qiáng)度未見(jiàn)明顯差異。第三部分：①骨組織Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)因子mRNA表達(dá)：ED組LRP5的表達(dá)最高(P0.01), ED+DM組最低(P0.01),BC組和DM組未見(jiàn)明顯差異；ED組β-catenin的表達(dá)最高(P0.01),DM組和ED+DM組略低,ED+DM組低于DM組(P0.05)；ED組Runx2的表達(dá)明顯升高(P0.01),DM組和ED+DM組略降低(P0.05),DM組和ED+DM組之間未見(jiàn)差異。②骨組織NF-κB信號(hào)通路相關(guān)因子mRNA表達(dá)：ED組RANKL的表達(dá)略升高(P0.05), ED+DM組明顯升高(P0.01),DM組未見(jiàn)明顯變化；四組OPG的表達(dá)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；RANKL/OPG比值與RANKL的表達(dá)趨勢(shì)相同,ED組略升高(P0.05),ED+DM組最高(P0.01),DM組未見(jiàn)明顯變化；ED組、DM組、ED+DM組TRAF6的表達(dá)均升高(P0.05),其中ED組升高較明顯(P0.01),但是ED組、DM組、ED+DM組三組間未見(jiàn)明顯差異；ED組NF-κB的表達(dá)升高(P0.01),DM組、ED+DM組降低(P0.01),DM組和ED+DM組之間未見(jiàn)明顯差異。結(jié)論：1、去勢(shì)與1型糖尿病造成的骨質(zhì)疏松在骨小梁形態(tài)上存在明顯差異,前者主要表現(xiàn)為骨小梁數(shù)量的減少和缺失；后者則表現(xiàn)為骨小梁厚度明顯變細(xì),骨小梁斷裂。去勢(shì)合并1型糖尿病時(shí)骨小梁數(shù)量明顯減少,髓腔空隙明顯增加,骨質(zhì)破壞和丟失程度最為嚴(yán)重。2、在去勢(shì)引起的骨質(zhì)疏松模型中,NF-κB和Wnt/β-catenin信號(hào)通路均被激活,骨形成和骨吸收活性增強(qiáng),表現(xiàn)為高轉(zhuǎn)換型骨改建特征,造成骨量丟失。3、單純1型糖尿病骨質(zhì)疏松癥發(fā)生時(shí),NF-κB與Wnt/β-catenin信號(hào)通路均下調(diào),骨吸收和骨形成均受到抑制,表現(xiàn)為低轉(zhuǎn)換型骨改建特征,造成骨量丟失。4、1型糖尿病能夠?qū)⒔^經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的高轉(zhuǎn)換型骨改建逆轉(zhuǎn)為低轉(zhuǎn)換型骨改建,并加速其骨量丟失,其具體作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R587.1;R580

【參考文獻(xiàn)】

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1 李曉宇;馮正平;;糖尿病性骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展[J];中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志;2014年05期

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本文編號(hào)：2325435