【摘要】：背景現(xiàn)代生活方式的改變使肥胖成為世界范圍內(nèi)的重大流行病,其發(fā)病率還在逐年上升,脂肪的過度累積和代謝異常所致的代謝紊亂,胰島素抵抗、血脂異常和心血管疾病嚴(yán)重威脅人類健康,而肥胖及其并發(fā)癥的發(fā)生均與脂肪組織密不可分。機(jī)體內(nèi)的脂肪組織可以分為白色脂肪(WAT)和棕色脂肪(BAT)。白色脂肪以儲存能量為主,也可分泌多種脂肪因子參與調(diào)控機(jī)體代謝；棕色脂肪的主要功能是產(chǎn)熱以維持體溫,其線粒體內(nèi)膜富含解偶聯(lián)蛋白UCP1,可以將氧化呼吸產(chǎn)生的能量以熱的形式散發(fā)出去。白色脂肪主要分布在腹腔內(nèi)臟周圍和皮下,細(xì)胞呈現(xiàn)為單房脂滴,胞漿成分較少；棕色脂肪主要分布在嚙齒類動(dòng)物和人類新生兒的肩胛間,細(xì)胞內(nèi)有多個(gè)多房脂滴和豐富的線粒體,與產(chǎn)熱功能相適應(yīng)。在冷刺激和PPARγ激動(dòng)劑等誘導(dǎo)下,白色脂肪中會出現(xiàn)形態(tài)類似棕色脂肪并且表達(dá)UCP1的一類細(xì)胞,稱為米色脂肪細(xì)胞或誘導(dǎo)的棕色脂肪細(xì)胞,這一過程稱為白色脂肪棕色變。米色脂肪細(xì)胞因其高表達(dá)UCP1而區(qū)別于白色脂肪細(xì)胞,但又不同于棕色脂肪細(xì)胞,其UCP1的基礎(chǔ)水平較低,在受到外界因素的誘導(dǎo)才會高表達(dá)。充分激活的米色脂肪細(xì)胞UCP1的表達(dá)量與棕色脂肪細(xì)胞相當(dāng),也可通過UCP1解偶聯(lián)產(chǎn)熱,兩者統(tǒng)稱為產(chǎn)熱脂肪細(xì)胞。既往認(rèn)為成人體內(nèi)不存在BAT,直到2009年應(yīng)用18F-PET/CT掃描技術(shù)證實(shí)成人體內(nèi)存在有活性的BAT。近幾年研究發(fā)現(xiàn)成人中的BAT不同于動(dòng)物和新生兒,含有米色脂肪細(xì)胞。冷刺激可以激活交感神經(jīng)末梢釋放兒茶酚胺,激活脂肪細(xì)胞的β3腎上腺素能受體,通過Gs-cAMP-PKA途徑激活脂滴蛋白Perilipin、激素敏感性酯酶和脂肪甘油三酯酯酶,加速脂降解,產(chǎn)生游離脂肪酸。棕色和米色脂肪細(xì)胞可攝取目身降解和循環(huán)中大量的游離脂肪酸進(jìn)入線粒體氧化激活UCP1產(chǎn)熱。除此以外,活化的WAT還可以攝取循環(huán)中的葡萄糖。據(jù)此我們推斷冷刺激下WAT棕色化和BAT的活化可以改善機(jī)體代謝。內(nèi)臟脂肪(VAT)和皮下脂肪(SAT)均屬于白色脂肪,但兩者在兒茶酚胺誘導(dǎo)的脂降解的敏感性、脂蛋白脂肪酶的活性及脂肪因子的分泌上都有所不同,內(nèi)臟脂肪與代謝性疾病的關(guān)系更為密切。既往研究發(fā)現(xiàn)不同部位脂肪對棕色變的敏感性不同,包括冷刺激在內(nèi)許多誘導(dǎo)棕色變的因素較易激活小鼠皮下腹股溝處脂肪(subcWAT),而對附睪內(nèi)臟脂肪(eWAT)作用不明顯,因此eWAT也被稱為真正的白色脂肪。但以往冷刺激的研究集中在4℃,更冷環(huán)境下eWAT的改變未見報(bào)道,內(nèi)臟脂肪是否能由低溫誘導(dǎo)棕色化還不明確。本論文擬建立不同程度冷刺激,觀察正常和高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖(DIO)小鼠VAT以及SAT、BAT的變化。目的1.研究冷刺激對正常小鼠VAT以及SAT、BAT的影響；2.研究冷刺激對DIO小鼠VAT以及SAT、BAT的影響。方法1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵守山東大學(xué)齊魯醫(yī)院倫理委員會的規(guī)定及要求。7-8周齡雄性C57BL/6野生型小鼠,購自北京華阜康生物科技股份有限公司,引自美國Jackson Laboratory。2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組第一部分冷刺激模型的構(gòu)建(梯度降溫)：C57BL/6小鼠隨機(jī)分四組,30℃對照組和4℃、-10℃和-10℃/-20℃三個(gè)冷刺激組。冷刺激組置于18℃適應(yīng)一周后進(jìn)入4℃中一周。此后4℃組保持在4℃至4周后實(shí)驗(yàn)結(jié)束。-10℃和-10℃/-20℃組經(jīng)白天-5℃、夜晚4℃適應(yīng)三天后,再經(jīng)白天-10℃夜晚4℃適應(yīng)四天。此后-10℃組保持在-10℃中至3周后實(shí)驗(yàn)結(jié)束。-10℃/-20℃組則保持白天-20℃夜晚-10℃中至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。-10℃和-10℃/-20℃組的飲水頻繁更換,并在飼養(yǎng)籠中加入雪霜維持濕潤。30℃小鼠直接置于30℃中,時(shí)間與冷刺激組保持一致。第二部分C57BL/6給予含60%脂肪的高脂飲食4個(gè)月后隨機(jī)分為30℃,4℃,-10℃和-10℃/-20℃四個(gè)組,冷刺激方法同第一部分。3.小鼠核心體溫和血壓的檢測：上午10-12時(shí)測量小鼠直腸溫度為核心體溫；使用小動(dòng)物血壓計(jì)通過尾動(dòng)脈袖套方法測量小鼠血壓。4.小鼠脂肪的microPET掃描：小鼠饑餓約3小時(shí)后異氟烷吸入麻醉,尾靜脈注射200～300 μCi 18F-FDG。一小時(shí)后,將小鼠不同部位的脂肪組織快速解剖下來行microPET掃描。5.組織樣本收集：小鼠處死前空腹6-8小時(shí),麻醉后稱重、測量身長。依次打開腹腔,剪開膈肌,暴露心臟,心尖取血后生理鹽水灌注。取出小鼠各部位脂肪組織及臟器等,用于分子生物學(xué)檢測的組織迅速放入液氮,后置于-800℃；用于免疫組織學(xué)染色的則置于4%多聚甲醛中固定,后制備成石蠟切片。6.脂降解水平和血清leptin檢測：冷刺激結(jié)束時(shí)麻醉小鼠,分離eWAT體外用異丙腎上腺素刺激檢測脂降解產(chǎn)物甘油的水平。分離血清ELISA檢測leptin水平。7.組織學(xué)和免疫組化染色：對脂肪組織切片行HE染色和UCP1、線粒體標(biāo)記物Prohibitin、脂滴包膜蛋白Perilipin A和血管內(nèi)皮標(biāo)記物Endomucin的免疫組化染色。eWAT行CD31大體血管染色。8.基因芯片、qRT-PCR和Western Blot:提取正常小鼠新鮮eWAT的mRNA,行Affymetrix GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array芯片分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測eWAT、subcWAT和iBAT中棕色化、脂降解相關(guān)產(chǎn)熱基因Ucp1、Dio2、Cidea、Cox7al、脂肪因子Leptin、Adiponectin、 Irisin、Resistin及轉(zhuǎn)錄因子Pgcla、Prdml6和Ebf2的表達(dá)。Western Blot檢測提取的新鮮脂肪組織蛋白中UCP1的表達(dá)。9.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：計(jì)量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,統(tǒng)計(jì)分析采用t檢驗(yàn)及one-way ANOVA。P0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果1.冷刺激對正常小鼠飲食量、體重(BW)、體重指數(shù)(BMI)、各部位脂肪重量、各臟器重量、核心體溫和血壓的影響冷刺激增加小鼠飲食量,各冷刺激組間無顯著差異。體重、體重指數(shù)、各部位脂肪重量減少。BW、BMI和eWAT、subcWAT重量隨溫度降低逐漸減少。各冷刺激組心臟增大；肝、脾和腎臟4℃時(shí)增大,溫度降低而減輕；肺臟無明顯變化。各組核心體溫和血壓無顯著差異。2.冷刺激對正常小鼠VAT、SAT和BAT的影響內(nèi)臟脂肪eWAT、腹膜后脂肪(rWAT)和腸系膜脂肪(mWAT)的HE和脂滴包膜蛋白Perilipin A染色顯示冷刺激下脂肪細(xì)胞逐漸變小,并出現(xiàn)多房樣脂滴結(jié)構(gòu)；棕色化指標(biāo)UCP1的免疫組化染色陽性證實(shí)發(fā)生了棕色變。冷刺激程度越大,UCP1的陽性染色越多,線粒體標(biāo)記物Prohibitin和血管內(nèi)皮Endomucin、CD31的染色也逐漸增多。冷刺激可以增加subcWAT和iBAT的UCP1、Prohibitin和Endomucin染色,subcWAT的棕色化程度隨溫度的降低升高,而各冷刺激組間iBAT分析無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。qPCR和WB檢測UCP1的表達(dá)顯示冷刺激可以上調(diào)各部位脂肪UCP1的mRNA和蛋白水平。MicroPET掃描顯示隨著溫度的降低eWAT和subcWAT對18F-FDG的攝取增加,iBAT對18F-FDG的攝取在30℃時(shí)最低,冷刺激時(shí)明顯增加。3.基因芯片及冷刺激對正常小鼠各部位脂肪產(chǎn)熱基因、脂肪因子和棕色化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子mRNA水平的影響基因芯片結(jié)果顯示冷刺激可引起正常小鼠eWAT中一系列與代謝相關(guān)的通路改變,促進(jìn)脂降解的相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)。qPCR結(jié)果顯示冷刺激可上調(diào)正常小鼠eWAT和subcWAT中與棕色化及脂降解相關(guān)的產(chǎn)熱基因Dio2、Cidea和Cox7al的表達(dá),下調(diào)脂肪因子Leptin、Adiponectin、Irisin的表達(dá),對Resistin影響不大,棕色化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Pgcla變化不明顯,Prdml6和Ebf2表達(dá)降低或不變。除輕度上調(diào)Dio2外冷刺激顯著下調(diào)iBAT中Cidea、Cox7al、Leptin、Adiponectin、Irisin、Resistin、Pgclα、Prdm16和Ebf2表達(dá),提示冷刺激對不同部位脂肪的作用不同。4.冷刺激對DIO小鼠進(jìn)食量、體重、體重指數(shù)、各部位脂肪重量的影響冷刺激下DIO小鼠進(jìn)食量增加,體重、體重指數(shù)、各部位脂肪重量減少。BW、BMI和eWAT、subcWAT重量隨溫度降低逐漸減少,iBAT在各冷刺激組差別不明顯。5.冷刺激對DIO小鼠VAT、SAT和BAT的影響對肥胖小鼠內(nèi)臟脂肪eWAT、rWAT和mWAT的HE和脂滴包膜蛋白PerilipinA染色顯示熱中性時(shí)脂肪細(xì)胞直徑較大,胞內(nèi)為單個(gè)大脂滴,胞漿成分很少,低溫冷刺激可使脂肪細(xì)胞變小,并出現(xiàn)多房樣脂滴,UCP1染色呈現(xiàn)陽性。溫度越低,UCP1的表達(dá)量、線粒體含量和血管的密度也逐漸增高。冷刺激可減小肥胖小鼠subcWAT和iBAT的脂肪細(xì)胞大小,增加UCP1、Prohibitin和Endomucin染色。subcWAT的棕色化程度隨溫度的降低升高,而分析各冷刺激組間iBAT無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。肥胖小鼠subcWAT的棕色化程度明顯弱于正常小鼠。6.冷刺激對DIO小鼠各部位脂肪中產(chǎn)熱基因、脂肪因子和棕色化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的mRNA水平影響qPCR結(jié)果顯示冷刺激可上調(diào)肥胖小鼠eWAT和subcWAT中產(chǎn)熱基因UCP1、 Dio2、Cidea和Cox7al的表達(dá)；不同程度下調(diào)脂肪因子Leptin、Adiponectin、Irisin的mRNA水平；轉(zhuǎn)錄因子Pgcla的表達(dá)升高,Prdm16和Ebf2表達(dá)降低。冷刺激上調(diào)肥胖小鼠iBAT中產(chǎn)熱基因UCP1和Dio2表達(dá),下調(diào)Cidea、Leptin、 Adiponectin、Resistin、Pgcla、Prdm16和Ebf2表達(dá),Cox7a1、Irisin變化不明顯。7.冷刺激對正常和DIO小鼠脂降解的影響體外加入ISO刺激檢測eWAT的脂降解產(chǎn)物甘油水平顯示冷刺激促進(jìn)正常和肥胖小鼠的脂降解。結(jié)論1.冷刺激可減少正常及DIO小鼠各部位脂肪蓄積,并且此作用不依賴于進(jìn)食量；2.冷刺激可誘導(dǎo)正常小鼠VAT發(fā)生棕色變,同時(shí)激活BAT和皮下脂肪,VAT對冷刺激誘導(dǎo)棕色變的敏感性低于SAT；3.冷刺激可誘導(dǎo)DIO小鼠VAT發(fā)生棕色變,同時(shí)激活BAT和皮下脂肪,與正常小鼠相比DIO小鼠SAT對冷刺激的敏感性較低；4.冷刺激可改變VAT的表達(dá)譜,促進(jìn)脂降解相關(guān)基因表達(dá),加速脂降解；5.冷刺激在轉(zhuǎn)錄水平上影響VAT、SAT和BAT中產(chǎn)熱基因、脂肪因子和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),并且對各部位脂肪的作用不同。背景全球有超過1.9億的肥胖或超重人口,肥胖造成的胰島素抵抗、糖尿病、血脂紊亂、心血管疾病和脂肪肝等一系列代謝障礙給社會造成了沉重負(fù)擔(dān),而針對肥胖及其并發(fā)癥的有效治療手段進(jìn)展甚微。脂肪組織可根據(jù)機(jī)體需要隨時(shí)貯存和釋放脂質(zhì),其生理功能與全身代謝密切相關(guān)。脂肪細(xì)胞代謝紊亂是肥胖等代謝性疾病的主要病理生理基礎(chǔ)。目前認(rèn)為機(jī)體內(nèi)存在白色、棕色和米色三種脂肪細(xì)胞(AC)。不同類型AC在形態(tài)、來源、分布和功能上各不相同,白色AC主要功能是貯存甘油三酯和分泌脂肪因子,棕色AC則主要通過線粒體底物氧化和UCP1解偶聯(lián)釋放熱量。米色AC在形態(tài)和產(chǎn)熱功能上類似棕色AC,在外界刺激下高表達(dá)UCP1,因此也稱作可誘導(dǎo)的棕色AC。在兒茶酚胺、FGF-21和Irisin等因子作用下WAT中可出現(xiàn)米色AC,即WAT發(fā)生了棕色變。研究發(fā)現(xiàn)米色脂肪細(xì)胞在調(diào)控機(jī)體能量穩(wěn)態(tài)方面有重要作用。肥胖患者體內(nèi)米色AC減少,適應(yīng)性產(chǎn)熱能力下降。Sv129小鼠WAT招募米色AC的能力比C57BL/6小鼠強(qiáng),相同飼養(yǎng)條件下脂肪的蓄積明顯少于C57。敲除小鼠所有來源于Myf5+細(xì)胞的1A型BMP受體會導(dǎo)致棕色脂肪(BAT)的缺失,相對應(yīng)大量WAT棕色化而彌補(bǔ)了BAT缺失導(dǎo)致的產(chǎn)熱不足。脂肪細(xì)胞特異性敲除PRDM16對BAT無明顯作用,但明顯抑制了WAT的棕色化,可加重高脂飲食下肥胖、胰島素抵抗和脂肪肝的發(fā)病。據(jù)此我們推斷WAT棕色化可以改善機(jī)體代謝。肥胖引發(fā)的胰島素抵抗(IR),是造成2型糖尿病流行的重要因素。過度累積的脂肪出現(xiàn)代謝障礙,造成多余的脂質(zhì)異位蓄積在肝臟、肌肉中,引發(fā)脂毒性；脂肪細(xì)胞還可分泌多種因子,觸發(fā)炎癥反應(yīng)等,多種因素綜合作用導(dǎo)致IR和血脂紊亂的發(fā)生。脂肪組織,尤其是血流直接入肝臟的內(nèi)臟脂肪(VAT)的異常擴(kuò)增,可以分泌Adiponectin、Leptin、IL-6和IL-1β等脂肪因子及飽和、不飽和脂肪酸調(diào)控肝細(xì)胞的代謝和炎癥反應(yīng),加劇肝臟代謝紊亂,尤其是非酒精性脂肪肝(NAFLD)的發(fā)病。生活在高海拔地區(qū)的人和住在海平面附近的人相比空腹血糖更低,葡萄糖耐受更好。而且高海拔人群中肥胖和糖尿病的發(fā)病率更低,但具體原因不明,我們推測可能與生存環(huán)境溫度的差異激活脂肪組織有關(guān)。Shah RV等人研究發(fā)現(xiàn)不論BMI, VAT的蓄積與心血管危險(xiǎn)因素和冠狀動(dòng)脈鈣化相關(guān),而且相對于皮下脂肪,VAT與代謝綜合征的發(fā)病率相關(guān)性更強(qiáng)；2012年JAMA報(bào)道了大規(guī)模Dallas心臟研究中的發(fā)現(xiàn),肥胖患者VAT的量與IR程度和將來進(jìn)展為T2DM的危險(xiǎn)性相關(guān)；另有研究發(fā)現(xiàn)BAT活化的人較BAT陰性的對照NAFLD的發(fā)病率低。由此可見脂肪組織,尤其是VAT在IR和NAFLD的發(fā)病過程中起重要作用,而靶向VAT的干預(yù)手段有助于改善這些并發(fā)癥。本論文擬通過正常小鼠和高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖模型,研究冷刺激誘導(dǎo)VAT棕色變后全身代謝包括NST能力、脂質(zhì)代謝、胰島素敏感性和肝臟脂質(zhì)沉積等的改變并進(jìn)行相關(guān)機(jī)制研究。目的1.研究不同程度冷刺激對小鼠代謝的影響；2.研究內(nèi)臟脂肪棕色變改善小鼠代謝的相關(guān)機(jī)制。方法1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：7-8周齡雄性C57BL/6野生型小鼠購自北京北京華阜康生物科技股份有限公司,引自美國Jackson Laboratory。129S-Ucp1tmlKz/J小鼠,購自美國Jackson Laboratory。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵守山東大學(xué)齊魯醫(yī)院倫理委員會對動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的規(guī)定及要求。2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組第一部分正常小鼠冷刺激模型的構(gòu)建：同論文Ⅰ。第二部分飲食誘導(dǎo)的肥胖(DIO)小鼠冷刺激模型的構(gòu)建：同論文Ⅰ。第三部分附睪脂肪去除和移植實(shí)驗(yàn)：手術(shù)去除eWAT后行冷刺激,冷刺激方法同論文Ⅰ。脂肪移植實(shí)驗(yàn)30℃的小鼠隨機(jī)分為兩組,分別接受等量來自-10℃/-20℃或30℃小鼠的eWAT。第四部分UCP1-/-小鼠實(shí)驗(yàn)：對UCP1-/-小鼠實(shí)施冷刺激。第五部分p3腎上腺素能受體激動(dòng)實(shí)驗(yàn)：室溫下C57BL/6小鼠隨機(jī)分兩組,一組接受β3腎上腺素能受體激動(dòng)劑CL316243腹腔注射,另一組接受等量的生理鹽水作為對照。3. 小鼠血糖、糖耐量和胰島素耐量的檢測使用羅氏血糖儀和試紙檢測血糖。糖耐量實(shí)驗(yàn)小鼠過夜饑餓12h,胰島素耐量實(shí)驗(yàn)小鼠饑餓6 h,冷刺激組置于18℃、30℃組置于30℃饑餓。給予小鼠腹腔注射2g/kg體重葡萄糖或0.5U/kg(正常小鼠)或0.75U/kg(肥胖小鼠)體重胰島素之前和15、30、60、90和120分鐘后采尾端血測定血糖。4.小鼠代謝率的檢測：麻醉好的小鼠放置于33℃的小動(dòng)物呼吸代謝檢測儀中測量30分鐘基礎(chǔ)狀態(tài)下的氧耗量和二氧化碳呼出量,皮下注射1mg/kg體重去加腎上腺素后繼續(xù)檢測90分鐘代表非戰(zhàn)栗性產(chǎn)熱(NST)能力。5. 小鼠eWAT去除和移植手術(shù)：麻醉固定小鼠,外科手術(shù)操作,取下腹部正中縱向切口,暴露并鈍性分離去除附睪脂肪。對照組僅打開腹腔,移動(dòng)附睪脂肪。術(shù)后一周后開始18℃適應(yīng)期,冷刺激方法同前。麻醉小鼠后固定,備皮并消毒。取出供體小鼠eWAT,生理鹽水沖洗后剪碎,植于受體小鼠eWAT的褶皺中。6. 小鼠基因型鑒定及核心體溫檢測：鼠尾組織提取DNA, PCR擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳,根據(jù)片段大小確定基因型。上午10-12時(shí)測量小鼠直腸溫度為核心體溫。7.組織樣本收集：小鼠處死前空腹6-8小時(shí),麻醉后稱重、測量身長。依次打開腹腔,剪開膈肌,暴露心臟,心尖取血后生理鹽水灌注。取出小鼠各部位脂肪組織及臟器等,用于分子生物學(xué)檢測的組織快速放入液氮,后置于-80℃；用于免疫組織學(xué)染色的則置于4%多聚甲醛中固定,后制成石蠟或冰凍切片。8.小鼠血脂、血胰島素水平的檢測：冷刺激結(jié)束時(shí)麻醉小鼠并留取血液,檢測血清中TC、LDL-C、HDL-C、TG和NEFA的含量。應(yīng)用ELISA檢測血胰島素水平。9. 小鼠eWAT肌酸激酶、肌酸和磷酸化肌酸的檢測：冰上裂解制備eWAT的勻漿,分別檢測CK的活性,Creatine和PCr的含量。10.組織學(xué)和免疫組化染色：對脂肪組織石蠟切片行HE染色和UCP1、Prohibitin、Perilipin A和Endomucin的免疫組化染色。對肝臟冰凍切片行油紅O染色。11. qRT-PCR:提取新鮮eWAT的RNA,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測產(chǎn)熱基因UCP1、Dio2、 Cidea、Cox7al、脂肪因子Leptin、Adiponectin、Irisin、Resistin及轉(zhuǎn)錄因子Pgcla、 Prdm16和Ebf2的表達(dá)。12.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,統(tǒng)計(jì)分析采用t檢驗(yàn)、one-way ANOVA和two-way ANOVA。P0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果1. 冷刺激對正常小鼠代謝的影響NST檢測冷刺激可顯著增加小鼠的氧耗量和二氧化碳呼出量,-10℃和-10℃/-20℃的氧耗量和二氧化碳呼出量高于4℃,冷刺激顯著增強(qiáng)小鼠代謝,提高適應(yīng)性產(chǎn)熱能力。冷刺激可以顯著降低血TG、NEFA和LDL-C的水平,TG的降低呈現(xiàn)溫度依賴性,溫度越低下降越明顯。冷刺激有降低TC、HDL-C的趨勢,-10℃/-20℃組TC、HDL-C水平低于其他各組�？崭寡歉鹘M間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,-10℃/-20℃組的空腹胰島素水平顯著降低,GTT和ITT實(shí)驗(yàn)顯示-10℃和-10℃/-20℃組血糖水平和曲線下面積低于30℃和4℃,說明內(nèi)臟脂肪棕色化可以改善小鼠糖耐量和胰島素耐量。2.冷刺激對DIO小鼠代謝的影響與30℃相比,冷刺激可增加DIO小鼠的代謝,-10℃和-10℃/-20℃組的NST能力高于4℃。冷刺激顯著降低血TG、TC和LDL-C的水平,-10℃和-10℃/-20℃組TG水平低于4℃組。冷刺激可以明顯降低DIO小鼠的空腹血糖和空腹胰島素水平,-10℃和-10℃/-20℃組血糖和胰島素水平低于4℃組。GTT和ITT實(shí)驗(yàn)顯示各-10℃和-10℃/-20℃組血糖水平和曲線下面積低于30℃和4℃,證實(shí)冷刺激改善肥胖小鼠糖耐量和胰島素耐量。冷刺激可以減輕DIO小鼠肝臟重量,減少肝內(nèi)的脂質(zhì)沉積。3. 內(nèi)臟脂肪棕色化可激活Creatine驅(qū)動(dòng)的替代產(chǎn)熱途徑,但UCP1主導(dǎo)的產(chǎn)熱起主要作用冷刺激可以增加eWAT中肌酸激酶(CK)的活性,棕色化程度越高,CK活性越高。冷刺激可增加eWAT中Creatine的含量,同時(shí)降低PCr的含量,-10℃/-20℃組Creatine含量最高,PCr含量最低,表明CK/Cr/PCr途徑被激活。冷刺激可降低UCP1-/-小鼠核心體溫,致使在零下低溫環(huán)境中無法存活,表明替代產(chǎn)熱途徑無法取代UCP1介導(dǎo)的產(chǎn)熱。4. eWAT的活化對全身代謝的影響eWAT去除后正常小鼠在低溫環(huán)境下的死亡率增高,NST能力受損,氧耗量、二氧化碳呼出量和胰島素敏感性均低于對照組。對熱中性小鼠移植活化的eWAT可使其NST能力比移植等量白色eWAT的小鼠增加。說明激活的內(nèi)臟脂肪參與調(diào)控機(jī)體代謝。5. β3腎上腺素能激動(dòng)劑CL316243對小鼠脂肪和代謝的影響CL316243 (CL)處理模擬了冷刺激對小鼠脂肪的作用。與對照組相比,CL組的體重、體重指數(shù)、各部位脂肪重量減少。CL處理組eWAT、subcWAT和iBAT的脂肪細(xì)胞比鹽水組減小,UCP1表達(dá)量、線粒體含量和血管密度明顯增加。與對照相比,CL組eWAT的產(chǎn)熱基因mRNA水平升高,脂肪因子和棕色化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)不同程度降低。CL處理還可以降低血TG、TC、LDL-C水平,改善糖耐量和胰島素耐量。結(jié)論1.冷刺激可促進(jìn)正常和DIO小鼠的代謝和NST能力,激活的內(nèi)臟脂肪可影響小鼠的整體代謝。2. 冷刺激可降低正常和DIO小鼠血TG,改善糖耐量和胰島素耐量,減少DIO小鼠肝臟的脂質(zhì)沉積。3.棕色化的內(nèi)臟脂肪可同時(shí)利用UCP1和Creatine驅(qū)動(dòng)的線粒體底物循環(huán)增加產(chǎn)熱。4.p3腎上腺素能受體激活可能是冷刺激誘導(dǎo)內(nèi)臟脂肪棕色化并改善代謝的主要機(jī)制。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R589.2
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本文編號：2299755